Community-based diversity analyses, such as metabarcoding, are increasingly popular in the field of metazoan zooplankton community ecology. However, some of the methodological uncertainties remain, such as the potential inflation of diversity estimates resulting from contamination by pseudogene sequences. Furthermore, primer affinity to specific taxonomic groups might skew community composition and structure during PCR. In this study, we estimated OTU (operational taxonomic unit) richness, Shannon’s H’, and the phylum-level community composition of samples from a coastal zooplankton community using four approaches: complement DNA (cDNA) and genomic DNA (gDNA) mitochondrial COI (Cytochrome oxidase subunit I) gene amplicon, metatranscriptome sequencing, and morphological identification. Results of mismatch distribution demonstrated that 90% is good threshold percentage to differentiate intra- and inter-species. Moderate level of correlations appeared upon comparing the species/OTU richness estimated from the different methods. Results strongly indicated that diversity inflation occurred in the samples amplified from gDNA because of mitochondrial pseudogene contamination (overall, gDNA produced two times more richness compared with cDNA amplicons). The unique community compositions observed in the PCR-based methods indicated that taxonomic amplification bias had occurred during the PCR. Therefore, it is recommended that PCR-free approaches be used whenever resolving community structure represents an essential aspect of the analysis.

中文翻译：

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从补体 DNA 和基因组 DNA 扩增子、宏转录组学和形态学鉴定估计的浮游动物多样性和组成的比较分析

基于社区的多样性分析，例如元条形码，在后生动物浮游动物群落生态学领域越来越受欢迎。然而，一些方法学上的不确定性仍然存在，例如由假基因序列污染导致的多样性估计的潜在膨胀。此外，引物对特定分类群的亲和力可能会在 PCR 过程中扭曲群落组成和结构。在这项研究中，我们使用四种方法估计了沿海浮游动物群落样本的 OTU（操作分类单位）丰富度、香农 H' 和门级群落组成：补体 DNA（cDNA）和基因组 DNA（gDNA）线粒体 COI（细胞色素氧化酶亚基 I) 基因扩增子、宏转录组测序和形态学鉴定。错配分布的结果表明，90% 是区分种内和种间的良好阈值百分比。在比较从不同方法估计的物种/OTU 丰富度时，出现了中等水平的相关性。结果强烈表明，由于线粒体假基因污染，从 gDNA 扩增的样品中发生了多样性膨胀（总体而言，gDNA 产生的丰富度是 cDNA 扩增子的两倍）。在基于 PCR 的方法中观察到的独特群落组成表明在 PCR 期间发生了分类扩增偏差。因此，只要解析群落结构代表分析的一个重要方面，建议使用无 PCR 方法。在比较从不同方法估计的物种/OTU 丰富度时，出现了中等水平的相关性。结果强烈表明，由于线粒体假基因污染，从 gDNA 扩增的样品中发生了多样性膨胀（总体而言，gDNA 产生的丰富度是 cDNA 扩增子的两倍）。在基于 PCR 的方法中观察到的独特群落组成表明在 PCR 期间发生了分类扩增偏差。因此，只要解析群落结构代表分析的一个重要方面，建议使用无 PCR 方法。在比较从不同方法估计的物种/OTU 丰富度时，出现了中等水平的相关性。结果强烈表明，由于线粒体假基因污染，从 gDNA 扩增的样品中发生了多样性膨胀（总体而言，gDNA 产生的丰富度是 cDNA 扩增子的两倍）。在基于 PCR 的方法中观察到的独特群落组成表明在 PCR 期间发生了分类扩增偏差。因此，只要解析群落结构代表分析的一个重要方面，建议使用无 PCR 方法。结果强烈表明，由于线粒体假基因污染，从 gDNA 扩增的样品中发生了多样性膨胀（总体而言，gDNA 产生的丰富度是 cDNA 扩增子的两倍）。在基于 PCR 的方法中观察到的独特群落组成表明在 PCR 期间发生了分类扩增偏差。因此，只要解析群落结构代表分析的一个重要方面，建议使用无 PCR 方法。结果强烈表明，由于线粒体假基因污染，从 gDNA 扩增的样品中发生了多样性膨胀（总体而言，gDNA 产生的丰富度是 cDNA 扩增子的两倍）。在基于 PCR 的方法中观察到的独特群落组成表明在 PCR 期间发生了分类扩增偏差。因此，只要解析群落结构代表分析的一个重要方面，建议使用无 PCR 方法。