Super-resolution microscopy has catalyzed valuable insights into the sub-cellular, mechanistic details of many different biological processes across a wide range of cell types. Fluorescence polarization spectroscopy tools have also enabled important insights into cellular processes through identifying orientational changes of biological molecules typically at an ensemble level. Here, we combine these two biophysical methodologies in a single home-made instrument to enable the simultaneous detection of orthogonal fluorescence polarization signals from single fluorescent protein molecules used as common reporters on the localization of proteins in cellular processes. These enable measurement of spatial location to a super-resolved precision better than the diffraction-limited optical resolution, as well as estimation of molecular stoichiometry based on the brightness of individual fluorophores. In this innovation we have adapted a millisecond timescale microscope used for single-molecule detection to enable splitting of fluorescence polarization emissions into two separate imaging channels for s- and p-polarization signals, which are imaged onto separate halves of the same high sensitivity back-illuminated CMOS camera detector. We applied this fluorescence polarization super-resolved imaging modality to a range of test fluorescent samples relevant to the study of biological processes, including purified monomeric green fluorescent protein, single combed DNA molecules, and protein assemblies and complexes from live Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae cells. Our findings are qualitative but demonstrate promise in showing how fluorescence polarization and super-resolved localization microscopy can be combined on the same sample to enable simultaneous measurements of polarization and stoichiometry of tracked molecular complexes, as well as the translational diffusion coefficient.

超分辨率显微镜促进了对广泛细胞类型中许多不同生物过程的亚细胞机制细节的宝贵见解。荧光偏振光谱工具还通过在整体水平上识别生物分子的方向变化，从而对细胞过程进行了重要的了解。在这里，我们将这两种生物物理方法结合在一个自制的仪器中，从而能够同时检测来自单个荧光蛋白分子的正交荧光偏振信号，这些分子用作细胞过程中蛋白质定位的常见记者。这些使空间位置的测量达到比衍射极限光学分辨率更好的超分辨率精度，以及基于单个荧光团的亮度估计分子化学计量。在这项创新中，我们采用了用于单分子检测的毫秒时间尺度显微镜，以将荧光偏振发射分成两个独立的成像通道，用于 s 和 p 偏振信号，这些信号被成像到相同高灵敏度背面的单独一半上。发光的 CMOS 相机探测器。我们将这种荧光偏振超分辨成像模式应用于一系列与生物过程研究相关的测试荧光样品，包括纯化的单体绿色荧光蛋白、单梳 DNA 分子以及来自活体的蛋白质组装体和复合物。在这项创新中，我们采用了用于单分子检测的毫秒时间尺度显微镜，以将荧光偏振发射分成两个独立的成像通道，用于 s 和 p 偏振信号，这些信号被成像到相同高灵敏度背面的单独一半上。发光的 CMOS 相机探测器。我们将这种荧光偏振超分辨成像模式应用于一系列与生物过程研究相关的测试荧光样品，包括纯化的单体绿色荧光蛋白、单梳 DNA 分子以及来自活体的蛋白质组装体和复合物。在这项创新中，我们采用了用于单分子检测的毫秒时间尺度显微镜，以便将荧光偏振发射分成两个独立的成像通道，用于 s 和 p 偏振信号，这些通道被成像到相同高灵敏度背面的单独一半上。发光的 CMOS 相机探测器。我们将这种荧光偏振超分辨成像模式应用于一系列与生物过程研究相关的测试荧光样品，包括纯化的单体绿色荧光蛋白、单梳 DNA 分子以及来自活体的蛋白质组装体和复合物。它们被成像到相同的高灵敏度背照式 CMOS 相机探测器的不同部分。我们将这种荧光偏振超分辨成像模式应用于一系列与生物过程研究相关的测试荧光样品，包括纯化的单体绿色荧光蛋白、单梳 DNA 分子以及来自活体的蛋白质组装体和复合物。它们被成像到相同的高灵敏度背照式 CMOS 相机探测器的不同部分。我们将这种荧光偏振超分辨成像模式应用于一系列与生物过程研究相关的测试荧光样品，包括纯化的单体绿色荧光蛋白、单梳 DNA 分子以及来自活体的蛋白质组装体和复合物。大肠杆菌和酿酒酵母细胞。我们的研究结果是定性的，但证明了如何将荧光偏振和超分辨定位显微镜结合在同一样品上，以同时测量跟踪分子复合物的偏振和化学计量，以及平移扩散系数。