Tristetraprolin (TTP) family proteins contain conserved tandem CCCH zinc-finger binding to AU-rich elements and C-terminal NOT1-binding domain. TTP is phosphorylated extensively in cells, and its mRNA destabilization activity is regulated by protein phosphorylation. We generated an antibody against phospho-Serine316 located at the C-terminal NOT1-binding site and examined TTP phosphorylation in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Knockout of TTP was created in RAW264.7 cells using CRISPR/Cas9 gene editing to explore TTP functions. We demonstrated that Ser316 was phosphorylated by p90 ribosomal S6 kinase 1 (RSK1) and p38-activated protein kinase (MK2) and dephosphorylated by Protein Phosphatase 2A (PP2A). A phosphorylation-mimic mutant of S316D resulted in dissociation with the CCR4-NOT deadenylase complex through weakening interaction with CNOT1. Furthermore, Ser316 and serines 52 and 178 were independently contributed to the CCR4-NOT complex recruitment in the immunoprecipitation assay using phosphor-mimic mutants. In RAW264.7 macrophages, TTP was induced, and Ser316 was phosphorylated through RSK1 and MK2 by LPS stimulation. Knockout of TTP resulted in TNFα mRNA increased due to mRNA stabilization. Overexpression of non-phosphorylated S316A TTP mutant can restore TTP activity and lead to TNFα mRNA decreased. GST pull-down and RNA pull-down analyses demonstrated that endogenous TTP with Ser316 phosphorylation decreased the interaction with CNOT1. Our results suggest that the TTP-mediated mRNA stability is modulated by Ser316 phosphorylation via regulating the TTP interaction with the CCR4-NOT deadenylase complex.

中文翻译：

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三四脯氨酸在 C 端 NOT1 结合域磷酸化的功能表征

三四脯氨酸 (TTP) 家族蛋白包含保守的串联 CCCH 锌指结合到富含 AU 的元素和 C 端 NOT1 结合域。TTP 在细胞中被广泛磷酸化，其 mRNA 去稳定活性受蛋白质磷酸化的调节。我们生成了一种针对位于 C 端 NOT1 结合位点的磷酸丝氨酸 316 的抗体，并检查了 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞中的 TTP 磷酸化。使用 CRISPR/Cas9 基因编辑在 RAW264.7 细胞中创建 TTP 敲除以探索 TTP 功能。我们证明 Ser316 被 p90 核糖体 S6 激酶 1 (RSK1) 和 p38 活化蛋白激酶 (MK2) 磷酸化，并被蛋白磷酸酶 2A (PP2A) 去磷酸化。S316D 的磷酸化模拟突变体通过减弱与 CNOT1 的相互作用导致与 CCR4-NOT 脱腺苷酸酶复合物解离。此外，在使用磷模拟突变体的免疫沉淀测定中，Ser316 和丝氨酸 52 和 178 独立地促进了 CCR4-NOT 复合物的募集。在 RAW264.7 巨噬细胞中，TTP 被诱导，Ser316 被 LPS 刺激通过 RSK1 和 MK2 磷酸化。由于 mRNA 稳定，TTP 的敲除导致 TNFα mRNA 增加。过表达非磷酸化的 S316A TTP 突变体可以恢复 TTP 活性并导致 TNFα mRNA 降低。GST 下拉和 RNA 下拉分析表明，具有 Ser316 磷酸化的内源性 TTP 降低了与 CNOT1 的相互作用。我们的结果表明，TTP 介导的 mRNA 稳定性受 Ser316 磷酸化调节，通过调节 TTP 与 CCR4-NOT 脱腺苷酶复合物的相互作用。在使用磷模拟突变体的免疫沉淀测定中，Ser316 和丝氨酸 52 和 178 独立地促成了 CCR4-NOT 复合物的募集。在 RAW264.7 巨噬细胞中，TTP 被诱导，Ser316 被 LPS 刺激通过 RSK1 和 MK2 磷酸化。由于 mRNA 稳定，TTP 的敲除导致 TNFα mRNA 增加。过表达非磷酸化的 S316A TTP 突变体可以恢复 TTP 活性并导致 TNFα mRNA 降低。GST 下拉和 RNA 下拉分析表明，具有 Ser316 磷酸化的内源性 TTP 降低了与 CNOT1 的相互作用。我们的结果表明，TTP 介导的 mRNA 稳定性受 Ser316 磷酸化调节，通过调节 TTP 与 CCR4-NOT 脱腺苷酶复合物的相互作用。在使用磷模拟突变体的免疫沉淀测定中，Ser316 和丝氨酸 52 和 178 独立地促成了 CCR4-NOT 复合物的募集。在 RAW264.7 巨噬细胞中，TTP 被诱导，Ser316 被 LPS 刺激通过 RSK1 和 MK2 磷酸化。由于 mRNA 稳定，TTP 的敲除导致 TNFα mRNA 增加。过表达非磷酸化的 S316A TTP 突变体可以恢复 TTP 活性并导致 TNFα mRNA 降低。GST 下拉和 RNA 下拉分析表明，具有 Ser316 磷酸化的内源性 TTP 降低了与 CNOT1 的相互作用。我们的结果表明，TTP 介导的 mRNA 稳定性受 Ser316 磷酸化调节，通过调节 TTP 与 CCR4-NOT 脱腺苷酶复合物的相互作用。在 RAW264.7 巨噬细胞中，TTP 被诱导，Ser316 被 LPS 刺激通过 RSK1 和 MK2 磷酸化。由于 mRNA 稳定，TTP 的敲除导致 TNFα mRNA 增加。过表达非磷酸化的 S316A TTP 突变体可以恢复 TTP 活性并导致 TNFα mRNA 降低。GST 下拉和 RNA 下拉分析表明，具有 Ser316 磷酸化的内源性 TTP 降低了与 CNOT1 的相互作用。我们的结果表明，TTP 介导的 mRNA 稳定性受 Ser316 磷酸化调节，通过调节 TTP 与 CCR4-NOT 脱腺苷酶复合物的相互作用。在 RAW264.7 巨噬细胞中，TTP 被诱导，Ser316 被 LPS 刺激通过 RSK1 和 MK2 磷酸化。由于 mRNA 稳定，TTP 的敲除导致 TNFα mRNA 增加。过表达非磷酸化的 S316A TTP 突变体可以恢复 TTP 活性并导致 TNFα mRNA 降低。GST 下拉和 RNA 下拉分析表明，具有 Ser316 磷酸化的内源性 TTP 降低了与 CNOT1 的相互作用。我们的结果表明，TTP 介导的 mRNA 稳定性受 Ser316 磷酸化调节，通过调节 TTP 与 CCR4-NOT 脱腺苷酶复合物的相互作用。过表达非磷酸化的 S316A TTP 突变体可以恢复 TTP 活性并导致 TNFα mRNA 降低。GST 下拉和 RNA 下拉分析表明，具有 Ser316 磷酸化的内源性 TTP 降低了与 CNOT1 的相互作用。我们的结果表明，TTP 介导的 mRNA 稳定性受 Ser316 磷酸化调节，通过调节 TTP 与 CCR4-NOT 脱腺苷酶复合物的相互作用。过表达非磷酸化的 S316A TTP 突变体可以恢复 TTP 活性并导致 TNFα mRNA 降低。GST 下拉和 RNA 下拉分析表明，具有 Ser316 磷酸化的内源性 TTP 降低了与 CNOT1 的相互作用。我们的结果表明，TTP 介导的 mRNA 稳定性受 Ser316 磷酸化调节，通过调节 TTP 与 CCR4-NOT 脱腺苷酶复合物的相互作用。