Although many studies have focused on a role for hyaluronan (HA) of interstitial extracellular matrix (presumably produced by non-vascular “stromal” cells) in regulating vascular growth, we herein examine the influence of “autocrine HA” produced by vascular endothelial cells themselves on tubulogenesis, using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in angiogenic and vasculogenic three-dimensional collagen gel cultures. Relative to unstimulated controls, tubulogenic HUVECs upregulated HAS2 mRNA and increased the synthesis of cell-associated HA (but not HA secreted into media). Confocal microscopy/immunofluorescence on cultures fixed with neutral-buffered 10% formalin (NBF) revealed cytoplasmic HAS2 in HUVEC cords and tubes. Cultures fixed with NBF (with cetylpyridinium chloride added to retain HA), stained for HA using “affinity fluorescence” (biotinylated HA-binding protein with streptavidin-fluor), and viewed by confocal microscopy showed HA throughout tube lumens, but little/no HA on the abluminal sides of the tubes or in the surrounding collagen gel. Lumen formation in angiogenic and vasculogenic cultures was strongly suppressed by metabolic inhibitors of HA synthesis (mannose and 4-methylumbelliferone). Hyaluronidase strongly inhibited lumen formation in angiogenic cultures, but not in vasculogenic cultures (where developing lumens are not open to culture medium). Collectively, our results point to a role for autocrine, luminal HA in microvascular sprouting and lumen development. (J Histochem Cytochem 69: 415–428, 2021)

尽管许多研究都集中在间质细胞外基质（可能由非血管“基质”细胞产生）的透明质酸 (HA) 在调节血管生长中的作用，但我们在此研究了由血管内皮细胞本身产生的“自分泌 HA”的影响在血管生成和血管生成的三维胶原凝胶培养物中使用人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 进行小管生成。相对于未受刺激的对照，管状 HUVEC 上调了 HAS2 mRNA 并增加了细胞相关 HA 的合成（但不是分泌到培养基中的 HA）。用中性缓冲的 10% 福尔马林 (NBF) 固定培养物的共聚焦显微镜/免疫荧光显示 HUVEC 脐带和管中的细胞质 HAS2。用 NBF 固定的培养物（添加氯化十六烷基吡啶以保留 HA），使用“亲和荧光”（生物素化的 HA 结合蛋白与链霉亲和素-荧光）对 HA 进行染色，并通过共聚焦显微镜观察显示整个管腔内有 HA，但在管腔外侧或周围的胶原凝胶中几乎没有/没有 HA。HA 合成的代谢抑制剂（甘露糖和 4-甲基伞形酮）强烈抑制血管生成和血管生成培养物中的管腔形成。透明质酸酶强烈抑制血管生成培养物中的管腔形成，但在血管生成培养物中（其中发育中的管腔不向培养基开放）则不然。总的来说，我们的结果表明自分泌、管腔 HA 在微血管发芽和管腔发育中的作用。但在管的近腔侧或周围的胶原凝胶中几乎没有/没有 HA。HA 合成的代谢抑制剂（甘露糖和 4-甲基伞形酮）强烈抑制血管生成和血管生成培养物中的管腔形成。透明质酸酶强烈抑制血管生成培养物中的管腔形成，但在血管生成培养物中（其中发育中的管腔不向培养基开放）则不然。总的来说，我们的结果表明自分泌、管腔 HA 在微血管发芽和管腔发育中的作用。但在管的近腔侧或周围的胶原凝胶中几乎没有/没有 HA。HA 合成的代谢抑制剂（甘露糖和 4-甲基伞形酮）强烈抑制血管生成和血管生成培养物中的管腔形成。透明质酸酶强烈抑制血管生成培养物中的管腔形成，但在血管生成培养物中（其中发育中的管腔不向培养基开放）则不然。总的来说，我们的结果表明自分泌、管腔 HA 在微血管发芽和管腔发育中的作用。但不是在血管源性培养物中（其中发育中的管腔不对培养基开放）。总的来说，我们的结果表明自分泌、管腔 HA 在微血管发芽和管腔发育中的作用。但不是在血管源性培养物中（其中发育中的管腔不对培养基开放）。总的来说，我们的结果表明自分泌、管腔 HA 在微血管发芽和管腔发育中的作用。(J Histochem Cytochem 69: 415–428, 2021)