miR-1250 is localised to the second intron of AATK at chromosome 17q25. As a CpG island is present at the putative promoter region of its host gene, AATK, we postulated that the intronic miR-1250-5p is a tumor suppressor miRNA co-regulated with its host gene, AATK, by promoter DNA methylation in non-Hodgkin’s lymphoma (NHL). AATK/miR-1250 methylation was studied in healthy controls, including ten normal peripheral blood buffy coats and eleven normal tonsils, ten lymphoma cell lines, and 120 primary lymphoma samples by methylation-specific PCR (MSP). The expression of miR-1250-5p and AATK was investigated by quantitative real-time PCR. Tumor suppressor properties of miR-1250-5p were demonstrated by over-expression of precursor miR-1250-5p in lymphoma cells. The target of miR-1250-5p was verified by luciferase reporter assay. AATK/miR-1250 methylation was absent in healthy peripheral blood and tonsils, but detected in five (50%) NHL cell lines. AATK/miR-1250 methylation correlated with repression of miR-1250-5p and AATK in NHL cell lines. In completely methylated SU-DHL-6 and SUP-T1 cells, treatment with 5-AzadC led to promoter demethylation and re-expression of both miR-1250-5p and AATK. In primary lymphoma samples, AATK/miR-1250 was frequently methylated in B-cell lymphoma (n = 41, 44.09%) and T-cell lymphoma (n = 9, 33.33%) with a comparable frequency (P = 0.318). In SU-DHL-6 and SU-DHL-1 cells, restoration of miR-1250-5p resulted in decreased cellular proliferation by MTS assay, increased cell death by trypan blue staining and enhanced apoptosis by annexin V-PI assay. Moreover, MAPK1 and WDR1 were verified as direct targets of miR-1250-5p by luciferase assay. In 39 primary NHLs, miR-1250-5p expression was shown to be inversely correlated with each of MAPK1 (P = 0.05) and WDR1 (P = 0.031) by qRT-PCR. Finally, in SU-DHL-1 cells, overexpression of miR-1250-5p led to repression of MAPK1 and WDR1 at both transcript and protein levels, with downregulation of phospho-ERK2 by Western-blotting and inhibition of SDF-1-dependent cell migration by transwell assay. miR-1250-5p is a novel tumor suppressive intronic miRNA co-regulated and silenced by promoter DNA methylation of its host gene AATK in NHL. MAPK1 and WDR1 are novel miR-1250-5p direct targets rendering inhibition of MAPK/ERK signaling and SDF-1-dependent cell migration, hence implicated in survival and dissemination of lymphoma.

中文翻译：

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miR-1250-5p 是一种在非霍奇金淋巴瘤中高甲基化的新型肿瘤抑制性内含子 miRNA：影响 ERK 信号传导和细胞迁移的新靶点

miR-1250 定位于染色体 17q25 处 AATK 的第二个内含子。由于 CpG 岛存在于其宿主基因 AATK 的推定启动子区域，我们假设内含子 miR-1250-5p 是与其宿主基因 AATK 共同调节的肿瘤抑制 miRNA，通过启动子 DNA 甲基化在非霍奇金淋巴瘤（NHL）。通过甲基化特异性 PCR (MSP) 在健康对照中研究 AATK/miR-1250 甲基化，包括 10 个正常外周血血沉棕黄层和 11 个正常扁桃体、10 个淋巴瘤细胞系和 120 个原发性淋巴瘤样品。通过定量实时PCR研究miR-1250-5p和AATK的表达。miR-1250-5p 的肿瘤抑制特性通过前体 miR-1250-5p 在淋巴瘤细胞中的过表达来证明。miR-1250-5p 的靶点通过荧光素酶报告基因测定进行验证。AATK/miR-1250 甲基化在健康的外周血和扁桃体中不存在，但在五种 (50%) NHL 细胞系中检测到。AATK/miR-1250 甲基化与 NHL 细胞系中 miR-1250-5p 和 AATK 的抑制相关。在完全甲基化的 SU-DHL-6 和 SUP-T1 细胞中，用 5-AzadC 处理导致 miR-1250-5p 和 AATK 的启动子去甲基化和重新表达。在原发性淋巴瘤样本中，AATK/miR-1250 在 B 细胞淋巴瘤（n = 41, 44.09%）和 T 细胞淋巴瘤（n = 9, 33.33%）中经常甲基化，频率相当（P = 0.318）。在 SU-DHL-6 和 SU-DHL-1 细胞中，通过 MTS 检测，miR-1250-5p 的恢复导致细胞增殖减少，通过台盼蓝染色增加细胞死亡，通过膜联蛋白 V-PI 检测增加细胞凋亡。此外，通过荧光素酶测定，MAPK1 和 WDR1 被证实为 miR-1250-5p 的直接靶标。在 39 个原发性 NHL 中，通过 qRT-PCR 显示 miR-1250-5p 表达与 MAPK1 (P = 0.05) 和 WDR1 (P = 0.031) 中的每一个呈负相关。最后，在 SU-DHL-1 细胞中，miR-1250-5p 的过表达导致 MAPK1 和 WDR1 在转录和蛋白质水平上的抑制，通过蛋白质印迹下调磷酸化 ERK2 并抑制 SDF-1 依赖性细胞通过 transwell 测定迁移。miR-1250-5p 是一种新型的肿瘤抑制性内含子 miRNA，在 NHL 中通过其宿主基因 AATK 的启动子 DNA 甲基化共同调节和沉默。MAPK1 和 WDR1 是新型 miR-1250-5p 直接靶标，可抑制 MAPK/ERK 信号传导和 SDF-1 依赖性细胞迁移，因此与淋巴瘤的存活和传播有关。031) 通过 qRT-PCR。最后，在 SU-DHL-1 细胞中，miR-1250-5p 的过表达导致 MAPK1 和 WDR1 在转录和蛋白质水平上的抑制，通过蛋白质印迹下调磷酸化 ERK2 并抑制 SDF-1 依赖性细胞通过 transwell 测定迁移。miR-1250-5p 是一种新型的肿瘤抑制性内含子 miRNA，在 NHL 中通过其宿主基因 AATK 的启动子 DNA 甲基化共同调节和沉默。MAPK1 和 WDR1 是新型 miR-1250-5p 直接靶标，可抑制 MAPK/ERK 信号传导和 SDF-1 依赖性细胞迁移，因此与淋巴瘤的存活和传播有关。031) 通过 qRT-PCR。最后，在 SU-DHL-1 细胞中，miR-1250-5p 的过表达导致 MAPK1 和 WDR1 在转录和蛋白质水平上的抑制，通过蛋白质印迹下调磷酸化 ERK2 并抑制 SDF-1 依赖性细胞通过 transwell 测定迁移。miR-1250-5p 是一种新型的肿瘤抑制性内含子 miRNA，在 NHL 中通过其宿主基因 AATK 的启动子 DNA 甲基化共同调节和沉默。MAPK1 和 WDR1 是新型 miR-1250-5p 直接靶标，可抑制 MAPK/ERK 信号传导和 SDF-1 依赖性细胞迁移，因此与淋巴瘤的存活和传播有关。通过蛋白质印迹下调磷酸化ERK2并通过transwell测定抑制SDF-1依赖性细胞迁移。miR-1250-5p 是一种新型的肿瘤抑制性内含子 miRNA，在 NHL 中通过其宿主基因 AATK 的启动子 DNA 甲基化共同调节和沉默。MAPK1 和 WDR1 是新型 miR-1250-5p 直接靶标，可抑制 MAPK/ERK 信号传导和 SDF-1 依赖性细胞迁移，因此与淋巴瘤的存活和传播有关。通过蛋白质印迹下调磷酸化ERK2并通过transwell测定抑制SDF-1依赖性细胞迁移。miR-1250-5p 是一种新型的肿瘤抑制性内含子 miRNA，在 NHL 中通过其宿主基因 AATK 的启动子 DNA 甲基化共同调节和沉默。MAPK1 和 WDR1 是新型 miR-1250-5p 直接靶标，可抑制 MAPK/ERK 信号传导和 SDF-1 依赖性细胞迁移，因此与淋巴瘤的存活和传播有关。