Hsp104, a yeast protein disaggregase, can be potentiated via numerous missense mutations at disparate locations throughout the coiled-coil middle domain (MD). Potentiated Hsp104 variants can counter the toxicity and misfolding of TDP-43, FUS, and α-synuclein, proteins which are implicated in neurodegenerative disorders. However, potentiated MD variants typically exhibit off-target toxicity. Further, it has remained confounding how numerous degenerate mutations confer potentiation, hampering engineering of therapeutic Hsp104 variants. Here, we sought to comprehensively define the key drivers of Hsp104 potentiation. Using scanning mutagenesis, we iteratively studied the effects of modulation at each position in the Hsp104 MD. Screening this library to identify enhanced variants reveals that missense mutations at 26% of positions in the MD yield variants that counter FUS toxicity. Modulation of the helix 2–helix 3/4 MD interface potentiates Hsp104, whereas mutations in the analogous helix 1–2 interface do not. Surprisingly, we find that there is a higher likelihood of enhancing Hsp104 activity against human disease substrates than impairing Hsp104 native function. We find that single mutations can broadly destabilize the MD structure and lead to functional potentiation, suggesting this may be a common mechanism conferring Hsp104 potentiation. Using this approach, we have demonstrated that modulation of the MD can yield engineered variants with decreased off-target effects.

中文翻译：

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通过扫描中间结构域的诱变揭示了 Hsp104 增强的驱动因素

Hsp104 是一种酵母蛋白解聚酶，可通过卷曲螺旋中间结构域 (MD) 中不同位置的大量错义突变增强。增强的 Hsp104 变体可以对抗 TDP-43、FUS 和 α-突触核蛋白的毒性和错误折叠，这些蛋白质与神经退行性疾病有关。然而，增强的 MD 变体通常表现出脱靶毒性。此外，它仍然混淆了众多简并突变如何赋予增强作用，从而阻碍治疗性 Hsp104 变体的工程化。在这里，我们试图全面定义 Hsp104 增强的关键驱动因素。使用扫描诱变，我们反复研究了 Hsp104 MD 中每个位置的调制效果。筛选该文库以鉴定增强的变体揭示了 MD 中 26% 位置的错义突变产生了对抗 FUS 毒性的变体。螺旋 2-螺旋 3/4 MD 界面的调节增强了 Hsp104，而类似的螺旋 1-2 界面中的突变则没有。令人惊讶的是，我们发现增强 Hsp104 对人类疾病底物的活性比削弱 Hsp104 天然功能的可能性更高。我们发现单个突变可以广泛地破坏 MD 结构并导致功能增强，这表明这可能是赋予 Hsp104 增强的常见机制。使用这种方法，我们已经证明 MD 的调节可以产生具有减少脱靶效应的工程变体。而类似的螺旋 1-2 界面中的突变则没有。令人惊讶的是，我们发现增强 Hsp104 对人类疾病底物的活性比削弱 Hsp104 天然功能的可能性更高。我们发现单个突变可以广泛地破坏 MD 结构并导致功能增强，这表明这可能是赋予 Hsp104 增强的常见机制。使用这种方法，我们已经证明 MD 的调节可以产生具有减少脱靶效应的工程变体。而类似的螺旋 1-2 界面中的突变则没有。令人惊讶的是，我们发现增强 Hsp104 对人类疾病底物的活性比削弱 Hsp104 天然功能的可能性更高。我们发现单个突变可以广泛地破坏 MD 结构并导致功能增强，这表明这可能是赋予 Hsp104 增强的常见机制。使用这种方法，我们已经证明 MD 的调节可以产生具有减少脱靶效应的工程变体。我们发现单个突变可以广泛地破坏 MD 结构并导致功能增强，这表明这可能是赋予 Hsp104 增强的常见机制。使用这种方法，我们已经证明 MD 的调节可以产生具有减少脱靶效应的工程变体。我们发现单个突变可以广泛地破坏 MD 结构并导致功能增强，这表明这可能是赋予 Hsp104 增强的常见机制。使用这种方法，我们已经证明 MD 的调节可以产生具有减少脱靶效应的工程变体。