Relatively high concentration of nitric oxide (NO) produced by inducible nitric oxide synthase (iNOS) in response to a variety of stimuli is a source of reactive nitrogen species, an important weapon of host innate immune defense. The SPRY domain-containing SOCS box protein 2 (SPSB2) is an E3 ubiquitin ligase that regulates the lifetime of iNOS. SPSB2 interacts with the N-terminal region of iNOS via a binding site on the SPRY domain of SPSB2, and recruits an E3 ubiquitin ligase complex to polyubiquitinate iNOS, leading to its proteasomal degradation. Although critical residues for the SPSB2-iNOS interaction have been identified, structural basis for the interaction remains to be explicitly determined. In this study, we have determined a crystal structure of the N-terminal region of iNOS in complex with the SPRY domain of SPSB2 at 1.24 Å resolution. We have resolved the roles of some flanking residues, whose contribution to the SPSB2-iNOS interaction was structurally unclear previously. Furthermore, we have evaluated the effects of SPSB2 inhibitors on NO production using transient transfection and cell-penetrating peptide approaches, and found that such inhibitors can elevate NO production in RAW264.7 macrophages. These results thus provide a useful basis for the development of potent SPSB2 inhibitors as well as recruiting ligands for proteolysis targeting chimera (PROTAC) design.

诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 响应各种刺激而产生的相对高浓度的一氧化氮 (NO) 是活性氮的来源，是宿主先天免疫防御的重要武器。含有 SPRY 结构域的 SOCS 盒蛋白 2 (SPSB2) 是一种 E3 泛素连接酶，可调节 iNOS 的寿命。SPSB2 通过 SPSB2 的 SPRY 结构域上的结合位点与 iNOS 的 N 末端区域相互作用，并募集 E3 泛素连接酶复合物以多泛素化 iNOS，导致其蛋白酶体降解。尽管已经确定了 SPSB2-iNOS 相互作用的关键残基，但相互作用的结构基础仍有待明确确定。在这项研究中，我们以 1.24 Å 的分辨率确定了 iNOS 的 N 端区域与 SPSB2 的 SPRY 结构域复合的晶体结构。我们已经解决了一些侧翼残基的作用，它们对 SPSB2-iNOS 相互作用的贡献以前在结构上尚不清楚。此外，我们使用瞬时转染和细胞穿透肽方法评估了 SPSB2 抑制剂对 NO 产生的影响，发现此类抑制剂可以提高 RAW264.7 巨噬细胞中 NO 的产生。因此，这些结果为开发有效的 SPSB2 抑制剂以及为蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 设计招募配体提供了有用的基础。并发现此类抑制剂可以提高 RAW264.7 巨噬细胞中 NO 的产生。因此，这些结果为开发有效的 SPSB2 抑制剂以及为蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 设计招募配体提供了有用的基础。并发现此类抑制剂可以提高 RAW264.7 巨噬细胞中 NO 的产生。因此，这些结果为开发有效的 SPSB2 抑制剂以及为蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 设计招募配体提供了有用的基础。