The general transcription factor TFIID is a multiprotein complex that is essential for specific transcription initiation by RNA polymerase II. It is composed of the TATA box-binding protein (TBP) and ~13 different TBP-associated factors (TAFs). Purification of TFIID free of other general transcription factors and coactivators is essential to analyze the transcription regulatory mechanisms in reconstituted systems in vitro. A breakthrough in TFIID purification was the generation of HeLa cell lines that express a FLAG epitope-tagged TBP subunit and immunopurification protocols with monoclonal anti-FLAG antibodies. Purification of TFIID from HeLa nuclear extracts generally required a two-step purification procedure involving phosphocellulose P11 chromatography followed by anti-flag M2 affinity purification (Chiang et al., 1993; Ge et al., 1996) [1,2]. Here we show first that the MED26 (CRSP70) coactivator subunit of Mediator co-purifies with TFIID in the above two-step protocol and interacts strongly with TFIID under high salt conditions. We further show that a MED26-free TFIID complex can be obtained by including a simple additional DE52 chromatography step following P11 fractionation. Thus, we demonstrate that MED26 strongly interacts with TFIID and recommend the use of a P11-DE52-M2 resin affinity three-step purification procedure to obtain MED26-free TFIID for analyzing Mediator-dependent transcription regulatory mechanisms in purified transcription systems in vitro.

通用转录因子 TFIID 是一种多蛋白复合物，对于 RNA 聚合酶 II 的特定转录起始至关重要。它由 TATA 盒结合蛋白 (TBP) 和约 13 种不同的 TBP 相关因子 (TAF) 组成。纯化不含其他通用转录因子和共激活剂的 TFIID 对于分析体外重组系统中的转录调控机制至关重要。TFIID 纯化的一个突破是产生了表达 FLAG 表位标记的 TBP 亚基的 HeLa 细胞系和使用单克隆抗 FLAG 抗体的免疫纯化方案。从 HeLa 核提取物中纯化 TFIID 通常需要两步纯化程序，包括磷酸纤维素 P11 层析，然后是 anti-flag M2 亲和纯化（Chiang 等人，1993 年；Ge 等人，1996 年）[1,2]。在这里，我们首先展示了 Mediator 的 MED26 (CRSP70) 共激活子亚基在上述两步协议中与 TFIID 共纯化，并在高盐条件下与 TFIID 强烈相互作用。我们进一步表明，通过在 P11 分馏后加入一个简单的额外 DE52 色谱步骤，可以获得不含 MED26 的 TFIID 复合物。因此，我们证明 MED26 与 TFIID 强烈相互作用，并建议使用 P11-DE52-M2 树脂亲和三步纯化程序来获得不含 MED26 的 TFIID，用于分析体外纯化转录系统中介质依赖的转录调控机制。我们进一步表明，通过在 P11 分馏后加入一个简单的额外 DE52 色谱步骤，可以获得不含 MED26 的 TFIID 复合物。因此，我们证明 MED26 与 TFIID 强烈相互作用，并建议使用 P11-DE52-M2 树脂亲和三步纯化程序来获得不含 MED26 的 TFIID，用于分析体外纯化转录系统中介质依赖的转录调控机制。我们进一步表明，通过在 P11 分馏后加入一个简单的额外 DE52 色谱步骤，可以获得不含 MED26 的 TFIID 复合物。因此，我们证明 MED26 与 TFIID 强烈相互作用，并建议使用 P11-DE52-M2 树脂亲和三步纯化程序来获得不含 MED26 的 TFIID，用于分析体外纯化转录系统中介质依赖的转录调控机制。