Oncolytic viruses (OVs) are novel cancer gene therapies that are moving toward the forefront of modern medicines. However, their full therapeutic potential is hindered by the lack of convenient and reliable strategies to visualize and quantify OV growth kinetics and therapeutic efficacy in live cells. In this study, we present an innovative imaging approach for single-cell real-time analysis of OV replication and efficacy in cancer cells. We selected SG33 as a prototypic new OV that derives from wild-type Myxoma virus (MYXV). Lausanne Toulouse 1 (T1) was used as control. We equipped SG33 and T1 genomes with the ANCHOR system and infected a panel of cell lines. The ANCHOR system is composed of a fusion protein (OR-GFP) that specifically binds to a short nonrepetitive DNA target sequence (ANCH) and spreads onto neighboring sequences by protein oligomerization. Its accumulation on the tagged viral DNA results in the creation of fluorescent foci. We found that (1) SG33 and T1-ANCHOR DNA can be readily detected and quantified by live imaging, (2) both OVs generate perinuclear replication foci after infection clustering into horse-shoe shape replication centers, and (3) SG33 replicates to higher levels as compared with T1. Lastly, as a translational proof of concept, we benchmarked SG33 replication and oncolytic efficacy in primary cancer cells derived from pancreatic adenocarcinoma (PDAC) both at the population and at the single-cell levels. In vivo, SG33 significantly replicates in experimental tumors to inhibit tumor growth. Collectively, we provide herein for the first time a novel strategy to quantify each step of OV infection in live cells and in real time by tracking viral DNA and provide first evidence of theranostic strategies for PDAC patients. Thus, this approach has the potential to rationalize the use of OVs for the benefit of patients with incurable diseases.

中文翻译：

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一种新的成像方法，用于单细胞实时分析溶瘤病毒在癌细胞中的复制和功效

溶瘤病毒 (OVs) 是一种新型癌症基因疗法，正在走向现代医学的前沿。然而，由于缺乏方便和可靠的策略来可视化和量化活细胞中的 OV 生长动力学和治疗效果，它们的全部治疗潜力受到阻碍。在这项研究中，我们提出了一种创新的成像方法，用于单细胞实时分析 OV 在癌细胞中的复制和功效。我们选择 SG33 作为源自野生型粘液瘤病毒 (MYXV) 的原型新 OV。洛桑图卢兹 1 (T1) 用作对照。我们为 SG33 和 T1 基因组配备了 ANCHOR 系统并感染了一组细胞系。ANCHOR 系统由一种融合蛋白 (OR-GFP) 组成，该融合蛋白 (OR-GFP) 与一个短的非重复 DNA 靶序列 (ANCH) 特异性结合，并通过蛋白质寡聚化扩散到相邻的序列上。它在标记的病毒 DNA 上的积累导致荧光灶的产生。我们发现 (1) SG33 和 T1-ANCHOR DNA 可以通过实时成像轻松检测和量化，(2) 两个 OV 在感染聚集到马蹄形复制中心后产生核周复制灶，以及 (3) SG33 复制到更高与T1相比的水平。最后，作为概念的转化证明，我们在群体和单细胞水平上对源自胰腺腺癌 (PDAC) 的原发性癌细胞的 SG33 复制和溶瘤功效进行了基准测试。它在标记的病毒 DNA 上的积累导致荧光灶的产生。我们发现 (1) SG33 和 T1-ANCHOR DNA 可以通过实时成像轻松检测和量化，(2) 两个 OV 在感染聚集到马蹄形复制中心后产生核周复制灶，以及 (3) SG33 复制到更高与T1相比的水平。最后，作为概念的转化证明，我们在群体和单细胞水平上对源自胰腺腺癌 (PDAC) 的原发性癌细胞的 SG33 复制和溶瘤功效进行了基准测试。它在标记的病毒 DNA 上的积累导致荧光灶的产生。我们发现 (1) SG33 和 T1-ANCHOR DNA 可以通过实时成像轻松检测和量化，(2) 两个 OV 在感染聚集到马蹄形复制中心后产生核周复制灶，以及 (3) SG33 复制到更高与T1相比的水平。最后，作为概念的转化证明，我们在群体和单细胞水平上对源自胰腺腺癌 (PDAC) 的原发性癌细胞的 SG33 复制和溶瘤功效进行了基准测试。(3) 与 T1 相比，SG33 复制到更高的水平。最后，作为概念的转化证明，我们在群体和单细胞水平上对源自胰腺腺癌 (PDAC) 的原发性癌细胞的 SG33 复制和溶瘤功效进行了基准测试。(3) 与 T1 相比，SG33 复制到更高的水平。最后，作为概念的转化证明，我们在群体和单细胞水平上对源自胰腺腺癌 (PDAC) 的原发性癌细胞的 SG33 复制和溶瘤功效进行了基准测试。在体内，SG33 在实验性肿瘤中显着复制以抑制肿瘤生长。总的来说，我们首次提供了一种新策略，通过跟踪病毒 DNA 实时量化活细胞中 OV 感染的每个步骤，并为 PDAC 患者提供治疗诊断策略的第一个证据。因此，这种方法有可能使 OVs 的使用合理化，以造福于患有不治之症的患者。