G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest class of cell surface drug targets. Advances in biochemical approaches for the stabilisation of GPCR:transducer complexes together with improvements in the technology and application of cryo-EM has recently opened up new possibilities for structure-assisted drug design of GPCR agonists. Nonetheless, limitations in the commercial application of some of these approaches, including the use of nanobody 35 (Nb35) for stabilisation of GPCR:Gs complexes, and the high cost of 300kV imaging have restricted broad application of cryo-EM in drug discovery. Here, using the PF 06882961-bound GLP-1R as exemplar, we validated formation of stable complexes with a modified Gs protein in the absence of Nb35 that had equivalent resolution in the drug binding pocket to complexes solved in the presence of Nb35, while the G protein displayed increased conformational dynamics. In parallel, we assessed the performance of 200kV versus 300kV image acquisition using a Falcon 4 or K3 direct electron detector. We show that with 300kV Krios, both bottom mounted Falcon 4 and energy filtered (25eV slit) Bio-Quantum K3 produced similar resolution. Moreover, the 200kV Glacios with bottom mounted Falcon 4 yielded a 3.2 Å map with clear density for bound drug and multiple structurally ordered waters. Our work paves the way for broader commercial application of cryo-EM for GPCR drug discovery.

中文翻译：

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用于GPCR药物发现的不断发展的cryo-EM结构方法

G蛋白偶联受体（GPCR）是细胞表面药物靶向的最大类别。用于稳定GPCR的生物化学方法的进展：传感器复合物以及cryo-EM技术和应用的改进，最近为GPCR激动剂的结构辅助药物设计开辟了新的可能性。但是，其中一些方法的商业应用受到限制，包括使用纳米抗体35（Nb35）稳定GPCR：Gs复合物，以及300kV成像的高昂费用限制了cryo-EM在药物发现中的广泛应用。在这里，以结合PF 06882961的GLP-1R为例，我们验证了在不存在Nb35的情况下用修饰的Gs蛋白形成的稳定复合物的形成，该复合物在药物结合口袋中的分辨率与存在Nb35时所解决的复合物的等效分辨率相同，而G蛋白显示出增加的构象动力学。同时，我们使用Falcon 4或K3直接电子检测器评估了200kV与300kV图像采集的性能。我们显示，对于300kV Krios，底部安装的Falcon 4和经过能量过滤（25eV狭缝）的Bio-Quantum K3都产生了相似的分辨率。此外，底部安装有Falcon 4的200kV Glacios产生了一个3.2Å的图，具有清晰的密度，可用于结合药物和多种结构有序的水。我们的工作为将cryo-EM用于GPCR药物发现的更广泛的商业应用铺平了道路。底部安装的Falcon 4和能量过滤（25eV狭缝）的Bio-Quantum K3产生了相似的分辨率。此外，底部安装有Falcon 4的200kV Glacios产生了一个3.2Å的图，具有清晰的密度，可用于结合药物和多种结构有序的水。我们的工作为将cryo-EM用于GPCR药物发现的更广泛的商业应用铺平了道路。底部安装的Falcon 4和能量过滤（25eV狭缝）的Bio-Quantum K3产生了相似的分辨率。此外，底部安装有Falcon 4的200kV Glacios产生了3.2Å的图，对于结合的药物和多种结构有序的水，其密度明显。我们的工作为将cryo-EM用于GPCR药物发现的更广泛的商业应用铺平了道路。