Methylation at the N6 position of adenosine (m6A) is one of the most abundant RNA modifications found in eukaryotes, however accurate detection of specific m6A nucleotides within transcripts has been historically challenging due to m6A and unmodified adenosine having virtually indistinguishable chemical properties. While previous strategies such as methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (MeRIP-Seq) have relied on m6A-specific antibodies to isolate RNA fragments containing the modification, these methods do not allow for precise identification of individual m6A residues. More recently, modified cross-linking and immunoprecipitation (CLIP) based approaches that rely on inducing specific mutations during reverse transcription via UV crosslinking of the anti-m6A antibody to methylated RNA have been employed to overcome this limitation. However, the most utilized version of this approach, miCLIP, can be technically challenging to use for achieving high-complexity libraries. Here we present an improved methodology that yields high library complexity and allows for the straightforward identification of individual m6A residues with reliable confidence metrics. Based on enhanced CLIP (eCLIP), our m6A-eCLIP (meCLIP) approach couples the improvements of eCLIP with the inclusion of an input sample and an easy-to-use computational pipeline to allow for precise calling of m6A sites at true single nucleotide resolution. As the effort to accurately identify m6As in an efficient and straightforward way intensifies, this method is a valuable tool for investigators interested in unraveling the m6A epitranscriptome.

中文翻译：

---

使用 eCLIP 和可访问的自定义分析管道以单核苷酸分辨率鉴定 m6A 残基

腺苷 (m6A) N6 位的甲基化是真核生物中发现的最丰富的 RNA 修饰之一，但由于 m6A 和未修饰的腺苷具有几乎无法区分的化学特性，准确检测转录本中的特定 m6A 核苷酸历来具有挑战性。虽然甲基 RNA 免疫沉淀和测序 (MeRIP-Seq) 等先前的策略依赖于 m6A 特异性抗体来分离包含修饰的 RNA 片段，但这些方法无法精确识别单个 m6A 残基。最近，基于改良交联和免疫沉淀 (CLIP) 的方法依赖于通过抗 m6A 抗体与甲基化 RNA 的紫外线交联在逆转录过程中诱导特定突变，已被用于克服这一限制。然而，这种方法最常用的版本 miCLIP 在技术上具有挑战性，可用于实现高复杂性库。在这里，我们提出了一种改进的方法，该方法可产生高文库复杂性，并允许使用可靠的置信度指标直接识别单个 m6A 残基。基于增强型 CLIP (eCLIP)，我们的 m6A-eCLIP (meCLIP) 方法将 eCLIP 的改进与包含输入样本和易于使用的计算管道相结合，以允许以真正的单核苷酸分辨率精确调用 m6A 位点. 随着以高效和直接的方式准确识别 m6A 的努力的加强，这种方法对于有兴趣解开 m6A 表观转录组的研究人员来说是一个有价值的工具。用于实现高复杂度库在技术上可能具有挑战性。在这里，我们提出了一种改进的方法，该方法可产生高文库复杂性，并允许使用可靠的置信度指标直接识别单个 m6A 残基。基于增强型 CLIP (eCLIP)，我们的 m6A-eCLIP (meCLIP) 方法将 eCLIP 的改进与包含输入样本和易于使用的计算管道相结合，以允许以真正的单核苷酸分辨率精确调用 m6A 位点. 随着以高效和直接的方式准确识别 m6A 的努力的加强，这种方法对于有兴趣解开 m6A 表观转录组的研究人员来说是一个有价值的工具。用于实现高复杂度库在技术上可能具有挑战性。在这里，我们提出了一种改进的方法，该方法可产生高文库复杂性，并允许使用可靠的置信度指标直接识别单个 m6A 残基。基于增强型 CLIP (eCLIP)，我们的 m6A-eCLIP (meCLIP) 方法将 eCLIP 的改进与包含输入样本和易于使用的计算管道相结合，以允许以真正的单核苷酸分辨率精确调用 m6A 位点. 随着以高效和直接的方式准确识别 m6A 的努力的加强，这种方法对于有兴趣解开 m6A 表观转录组的研究人员来说是一个有价值的工具。在这里，我们提出了一种改进的方法，该方法可产生高文库复杂性，并允许使用可靠的置信度指标直接识别单个 m6A 残基。基于增强型 CLIP (eCLIP)，我们的 m6A-eCLIP (meCLIP) 方法将 eCLIP 的改进与包含输入样本和易于使用的计算管道相结合，以允许以真正的单核苷酸分辨率精确调用 m6A 位点. 随着以高效和直接的方式准确识别 m6A 的努力的加强，这种方法对于有兴趣解开 m6A 表观转录组的研究人员来说是一个有价值的工具。在这里，我们提出了一种改进的方法，该方法可产生高文库复杂性，并允许使用可靠的置信度指标直接识别单个 m6A 残基。基于增强型 CLIP (eCLIP)，我们的 m6A-eCLIP (meCLIP) 方法将 eCLIP 的改进与包含输入样本和易于使用的计算管道相结合，以允许以真正的单核苷酸分辨率精确调用 m6A 位点. 随着以高效和直接的方式准确识别 m6A 的努力的加强，这种方法对于有兴趣解开 m6A 表观转录组的研究人员来说是一个有价值的工具。我们的 m6A-eCLIP (meCLIP) 方法将 eCLIP 的改进与包含输入样本和易于使用的计算管道相结合，以允许以真正的单核苷酸分辨率精确调用 m6A 位点。随着以高效和直接的方式准确识别 m6A 的努力的加强，这种方法对于有兴趣解开 m6A 表观转录组的研究人员来说是一个有价值的工具。我们的 m6A-eCLIP (meCLIP) 方法将 eCLIP 的改进与包含输入样本和易于使用的计算管道相结合，以允许以真正的单核苷酸分辨率精确调用 m6A 位点。随着以高效和直接的方式准确识别 m6A 的努力的加强，这种方法对于有兴趣解开 m6A 表观转录组的研究人员来说是一个有价值的工具。