Significance: Two-photon (2P) fluorescence imaging can provide background-free high-contrast images from the scattering tissues. However, obtaining a multiplane image is not straightforward. We present a two-photon volume holographic imaging (2P-VHI) system for multiplane imaging. Aim: Our goal was to design and implement a 2P-VHI system that can provide the high-contrast optically sectioned images at multiple planes. Approach: A 2P-VHI system is presented that incorporates angularly multiplexed volume holographic gratings and a femtosecond laser source for fluorescence excitation for multiplane imaging. A volume hologram with multiplexed gratings provides multifocal observation, whereas nonlinear excitation using a femtosecond laser helps in significantly enhancing both depth resolution and contrast of images. Results: Standard fluorescent beads are used to demonstrate the imaging performance of the 2P-VHI system. Two-depth resolved optical-sectioning images of fluorescently labeled thick mice intestine samples were obtained. In addition, the optical sectioning capability of our system is measured and compared with that of a conventional VHI system. Conclusions: Results demonstrated that 2P excitation in VHI systems provided the optical sectioning ability that helps in reducing background noise in the images. Integration of nonlinear fluorescence excitation in the VHI provides some unique advantages to the system and has potential to design multidepth optical sectioned spatial–spectral imaging systems.

中文翻译：

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体全息显微镜下组织结构的双光子荧光成像

意义：双光子 (2P) 荧光成像可以提供来自散射组织的无背景高对比度图像。然而，获得多平面图像并不简单。我们提出了一种用于多平面成像的双光子体积全息成像 (2P-VHI) 系统。目标：我们的目标是设计和实现一个 2P-VHI 系统，该系统可以在多个平面上提供高对比度的光学切片图像。方法：提出了一种 2P-VHI 系统，该系统结合了角度多路复用体全息光栅和飞秒激光源，用于多平面成像的荧光激发。具有多路复用光栅的体积全息图提供多焦点观察，而使用飞秒激光的非线性激发有助于显着提高图像的深度分辨率和对比度。结果：标准荧光珠用于演示 2P-VHI 系统的成像性能。获得了荧光标记的厚小鼠肠道样本的两个深度分辨光学切片图像。此外，我们测量了我们系统的光学切片能力，并与传统 VHI 系统的光学切片能力进行了比较。结论：结果表明 VHI 系统中的 2P 激发提供了有助于降低图像背景噪声的光学切片能力。VHI 中非线性荧光激发的集成为该系统提供了一些独特的优势，并具有设计多深度光学切片空间光谱成像系统的潜力。获得了荧光标记的厚小鼠肠道样本的两个深度分辨光学切片图像。此外，我们测量了我们系统的光学切片能力，并与传统 VHI 系统的光学切片能力进行了比较。结论：结果表明 VHI 系统中的 2P 激发提供了有助于降低图像背景噪声的光学切片能力。VHI 中非线性荧光激发的集成为该系统提供了一些独特的优势，并具有设计多深度光学切片空间光谱成像系统的潜力。获得了荧光标记的厚小鼠肠道样本的两个深度分辨光学切片图像。此外，我们测量了我们系统的光学切片能力，并与传统 VHI 系统的光学切片能力进行了比较。结论：结果表明 VHI 系统中的 2P 激发提供了有助于降低图像背景噪声的光学切片能力。VHI 中非线性荧光激发的集成为该系统提供了一些独特的优势，并具有设计多深度光学切片空间光谱成像系统的潜力。结果表明，VHI 系统中的 2P 激发提供了有助于降低图像背景噪声的光学切片能力。VHI 中非线性荧光激发的集成为该系统提供了一些独特的优势，并具有设计多深度光学切片空间光谱成像系统的潜力。结果表明，VHI 系统中的 2P 激发提供了有助于降低图像背景噪声的光学切片能力。VHI 中非线性荧光激发的集成为该系统提供了一些独特的优势，并具有设计多深度光学切片空间光谱成像系统的潜力。