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Spontaneous, solvent-free entrapment of siRNA within lipid nanoparticles
Nanoscale ( IF 5.8 ) Pub Date : 2020-11-02 , DOI: 10.1039/d0nr06816k Jayesh A. Kulkarni 1, 2, 3, 4, 5 , Sarah B. Thomson 2, 3, 4, 5, 6 , Josh Zaifman 2, 3, 6, 7, 8 , Jerry Leung 2, 3, 6, 7 , Pamela K. Wagner 2, 3, 4, 5, 6 , Austin Hill 2, 3, 4, 5, 6 , Yuen Yi C. Tam 2, 3, 6, 7, 8 , Pieter R. Cullis 1, 2, 3, 6, 7 , Terri L. Petkau 2, 3, 4, 5, 6 , Blair R. Leavitt 2, 3, 4, 5, 6
Nanoscale ( IF 5.8 ) Pub Date : 2020-11-02 , DOI: 10.1039/d0nr06816k Jayesh A. Kulkarni 1, 2, 3, 4, 5 , Sarah B. Thomson 2, 3, 4, 5, 6 , Josh Zaifman 2, 3, 6, 7, 8 , Jerry Leung 2, 3, 6, 7 , Pamela K. Wagner 2, 3, 4, 5, 6 , Austin Hill 2, 3, 4, 5, 6 , Yuen Yi C. Tam 2, 3, 6, 7, 8 , Pieter R. Cullis 1, 2, 3, 6, 7 , Terri L. Petkau 2, 3, 4, 5, 6 , Blair R. Leavitt 2, 3, 4, 5, 6
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Lipid nanoparticle (LNP) formulations of nucleic acid are leading vaccine candidates for COVID-19, and enabled the first approved RNAi therapeutic, Onpattro. LNPs are composed of ionizable cationic lipids, phosphatidylcholine, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG)-lipids, and are produced using rapid-mixing techniques. These procedures involve dissolution of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid in an acidic aqueous buffer (pH 4). These solutions are then combined using a continuous mixing device such as a T-mixer or microfluidic device. In this mixing step, particle formation and nucleic acid entrapment occur. Previous work from our group has shown that, in the absence of nucleic acid, the particles formed at pH 4 are vesicular in structure, a portion of these particles are converted to electron-dense structures in the presence of nucleic acid, and the proportion of electron-dense structures increases with nucleic acid content. What remained unclear from previous work was the mechanism by which vesicles form electron-dense structures. In this study, we use cryogenic transmission electron microscopy and dynamic light scattering to show that efficient siRNA entrapment occurs in the absence of ethanol (contrary to the established paradigm), and suggest that nucleic acid entrapment occurs through inversion of preformed vesicles. We also leverage this phenomenon to show that specialized mixers are not required for siRNA entrapment, and that preformed particles at pH 4 can be used for in vitro transfection.
中文翻译：
siRNA在脂质纳米颗粒中自发，无溶剂的包裹
核酸的脂质纳米颗粒（LNP）制剂是COVID-19的主要候选疫苗，使首个获批的RNAi治疗剂Onpattro成为可能。LNP由可电离的阳离子脂质，磷脂酰胆碱，胆固醇和聚乙二醇（PEG）-脂质组成，并使用快速混合技术生产。这些程序包括将脂质成分溶解在有机相中，将核酸溶解在酸性水性缓冲液（pH 4）中。然后使用连续混合装置（例如T型混合器或微流体装置）将这些溶液合并。在该混合步骤中，发生颗粒形成和核酸截留。我们小组的先前工作表明，在没有核酸的情况下，pH为4时形成的颗粒具有囊泡结构，这些部分的一部分在存在核酸的情况下转化为电子致密结构，并且电子致密结构的比例随核酸含量的增加而增加。从先前的工作中仍不清楚的是囊泡形成电子致密结构的机理。在这项研究中，我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来证明在没有乙醇的情况下有效的siRNA诱捕发生了（与已建立的范例相反），并建议通过预先形成的囊泡倒置发生了核酸诱捕。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒 电子致密结构的比例随核酸含量的增加而增加。从先前的工作中仍不清楚的是囊泡形成电子致密结构的机理。在这项研究中，我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来证明在没有乙醇的情况下有效的siRNA诱捕发生了（与已建立的范例相反），并建议通过预先形成的囊泡倒置发生了核酸诱捕。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒 电子致密结构的比例随核酸含量的增加而增加。从先前的工作中仍不清楚的是囊泡形成电子致密结构的机理。在这项研究中，我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来证明在没有乙醇的情况下有效的siRNA诱捕发生了（与已建立的范例相反），并建议通过预先形成的囊泡倒置发生了核酸诱捕。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒 我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来显示有效的siRNA诱捕发生在没有乙醇的情况下（与已建立的范例相反），并暗示核酸的诱捕通过预先形成的囊泡倒置发生。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒 我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来显示有效的siRNA诱捕发生在没有乙醇的情况下（与已建立的范例相反），并暗示核酸的诱捕通过预先形成的囊泡倒置发生。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒体外转染。
更新日期：2020-11-27
中文翻译：
siRNA在脂质纳米颗粒中自发，无溶剂的包裹
核酸的脂质纳米颗粒（LNP）制剂是COVID-19的主要候选疫苗，使首个获批的RNAi治疗剂Onpattro成为可能。LNP由可电离的阳离子脂质，磷脂酰胆碱，胆固醇和聚乙二醇（PEG）-脂质组成，并使用快速混合技术生产。这些程序包括将脂质成分溶解在有机相中，将核酸溶解在酸性水性缓冲液（pH 4）中。然后使用连续混合装置（例如T型混合器或微流体装置）将这些溶液合并。在该混合步骤中，发生颗粒形成和核酸截留。我们小组的先前工作表明，在没有核酸的情况下，pH为4时形成的颗粒具有囊泡结构，这些部分的一部分在存在核酸的情况下转化为电子致密结构，并且电子致密结构的比例随核酸含量的增加而增加。从先前的工作中仍不清楚的是囊泡形成电子致密结构的机理。在这项研究中，我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来证明在没有乙醇的情况下有效的siRNA诱捕发生了（与已建立的范例相反），并建议通过预先形成的囊泡倒置发生了核酸诱捕。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒 电子致密结构的比例随核酸含量的增加而增加。从先前的工作中仍不清楚的是囊泡形成电子致密结构的机理。在这项研究中，我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来证明在没有乙醇的情况下有效的siRNA诱捕发生了（与已建立的范例相反），并建议通过预先形成的囊泡倒置发生了核酸诱捕。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒 电子致密结构的比例随核酸含量的增加而增加。从先前的工作中仍不清楚的是囊泡形成电子致密结构的机理。在这项研究中，我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来证明在没有乙醇的情况下有效的siRNA诱捕发生了（与已建立的范例相反），并建议通过预先形成的囊泡倒置发生了核酸诱捕。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒 我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来显示有效的siRNA诱捕发生在没有乙醇的情况下（与已建立的范例相反），并暗示核酸的诱捕通过预先形成的囊泡倒置发生。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒 我们使用低温透射电子显微镜和动态光散射来显示有效的siRNA诱捕发生在没有乙醇的情况下（与已建立的范例相反），并暗示核酸的诱捕通过预先形成的囊泡倒置发生。我们还利用这种现象表明，不需要专门的混合器来捕获siRNA，并且可以使用pH为4的预先形成的颗粒体外转染。
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