Electron bifurcation uses free energy from exergonic redox reactions to power endergonic reactions. β-FAD of the electron transfer flavoprotein (EtfAB) from the anaerobic bacterium Acidaminococcus fermentans bifurcates the electrons of NADH, sending one to the low potential ferredoxin and the other to the high potential α-FAD semiquinone (α-FAD·-). The resultant α-FAD hydroquinone (α-FADH-) transfers one electron further to butyryl-CoA dehydrogenase (Bcd); two such transfers enable Bcd to reduce crotonyl-CoA to butyryl-CoA. To get insight into the mechanism of these intricate reactions, we constructed an artificial reaction only with EtfAB containing α-FAD or α-FAD·- to monitor formation of α-FAD·- or α-FADH-, respectively, using stopped flow kinetic measurements. In the presence of α-FAD, we observed that NADH transferred a hydride to β-FAD at a rate of 920 s-1, yielding the charge transfer complex NAD+:β-FADH- with an absorbance maximum at 650 nm. β-FADH- bifurcated one electron to α-FAD and the other electron to α-FAD of a second EtfAB molecule, forming two stable α-FAD·-. With α-FAD·-, the reduction of b-FAD with NADH was 1500-times slower. Reduction of β-FAD in the presence of α-FAD displayed a normal kinetic isotope effect (KIE) of 2.1, whereas the KIE was inverted in the presence of α-FAD·-. These data indicate that a nearby radical (14 Å apart) slows the rate of a hydride transfer and inverts the KIE. This unanticipated flavin chemistry is not restricted to Etf-Bcd but certainly occurs in other bifurcating Etfs found in anaerobic bacteria and archaea.

中文翻译：

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快速动力学揭示了来自发酵氨基酸球菌的分叉电子转移黄素蛋白中令人惊讶的黄素化学。

电子分叉利用来自放能氧化还原反应的自由能来为吸能反应提供动力。来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的电子转移黄素蛋白 (EtfAB) 的 β-FAD 将 NADH 的电子分叉，将一个电子发送到低电势铁氧还蛋白，另一个发送到高电势 α-FAD 半醌 (α-FAD·-)。生成的 α-FAD 对苯二酚 (α-FADH-) 将一个电子进一步转移至丁酰辅酶 A 脱氢酶 (Bcd)；两次这样的转移使 Bcd 能够将巴豆酰辅酶 A 还原为丁酰辅酶 A。为了深入了解这些复杂反应的机制，我们仅用含有 α-FAD 或 α-FAD·- 的 EtfAB 构建了人工反应，使用停流动力学分别监测 α-FAD·- 或 α-FADH- 的形成测量。在 α-FAD 存在下，我们观察到 NADH 以 920 s-1 的速率将氢化物转移到 β-FAD，产生电荷转移复合物 NAD+:β-FADH-，在 650 nm 处具有最大吸光度。β-FADH-将一个电子分叉为α-FAD，将另一个电子分叉为第二个EtfAB分子的α-FAD，形成两个稳定的α-FAD·-。对于 α-FAD·-，NADH 还原 b-FAD 的速度慢了 1500 倍。α-FAD 存在时 β-FAD 的还原表现出正常的动力学同位素效应 (KIE) 2.1，而 α-FAD·- 存在时 KIE 则相反。这些数据表明附近的自由基（相距 14 Å）会减慢氢化物转移速率并反转 KIE。这种意想不到的黄素化学不仅限于 Etf-Bcd，而且肯定会发生在厌氧细菌和古细菌中发现的其他分叉 Etf 中。β-FADH- 在 650 nm 处具有最大吸光度。β-FADH-将一个电子分叉为α-FAD，将另一个电子分叉为第二个EtfAB分子的α-FAD，形成两个稳定的α-FAD·-。对于 α-FAD·-，NADH 还原 b-FAD 的速度慢了 1500 倍。α-FAD 存在时 β-FAD 的还原表现出正常的动力学同位素效应 (KIE) 2.1，而 α-FAD·- 存在时 KIE 则相反。这些数据表明附近的自由基（相距 14 Å）会减慢氢化物转移速率并反转 KIE。这种意想不到的黄素化学不仅限于 Etf-Bcd，而且肯定会发生在厌氧细菌和古细菌中发现的其他分叉 Etf 中。β-FADH- 在 650 nm 处具有最大吸光度。β-FADH-将一个电子分叉为α-FAD，将另一个电子分叉为第二个EtfAB分子的α-FAD，形成两个稳定的α-FAD·-。对于 α-FAD·-，NADH 还原 b-FAD 的速度慢了 1500 倍。α-FAD 存在时 β-FAD 的还原表现出正常的动力学同位素效应 (KIE) 2.1，而 α-FAD·- 存在时 KIE 则相反。这些数据表明附近的自由基（相距 14 Å）会减慢氢化物转移速率并反转 KIE。这种意想不到的黄素化学不仅限于 Etf-Bcd，而且肯定会发生在厌氧细菌和古细菌中发现的其他分叉 Etf 中。用 NADH 还原 b-FAD 的速度要慢 1500 倍。α-FAD 存在时 β-FAD 的还原表现出正常的动力学同位素效应 (KIE) 2.1，而 α-FAD·- 存在时 KIE 则相反。这些数据表明附近的自由基（相距 14 Å）会减慢氢化物转移速率并反转 KIE。这种意想不到的黄素化学不仅限于 Etf-Bcd，而且肯定会发生在厌氧细菌和古细菌中发现的其他分叉 Etf 中。用 NADH 还原 b-FAD 的速度要慢 1500 倍。α-FAD 存在时 β-FAD 的还原表现出正常的动力学同位素效应 (KIE) 2.1，而 α-FAD·- 存在时 KIE 则相反。这些数据表明附近的自由基（相距 14 Å）会减慢氢化物转移速率并反转 KIE。这种意想不到的黄素化学不仅限于 Etf-Bcd，而且肯定会发生在厌氧细菌和古细菌中发现的其他分叉 Etf 中。