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Purification of Recombinant α-synuclein: A Comparison of Commonly Used Protocols
Biochemistry ( IF 2.9 ) Pub Date : 2020-11-25 , DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00725 Amberley D Stephens 1 , Dijana Matak-Vinkovic 2 , Ana Fernandez-Villegas 1 , Gabriele S Kaminski Schierle 1
Biochemistry ( IF 2.9 ) Pub Date : 2020-11-25 , DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00725 Amberley D Stephens 1 , Dijana Matak-Vinkovic 2 , Ana Fernandez-Villegas 1 , Gabriele S Kaminski Schierle 1
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The initial state of the intrinsically disordered protein α-synuclein (aSyn), e.g., the presence of oligomers and degradation products, or the presence of contaminants and adducts can greatly influence the aggregation kinetics and toxicity of the protein. Here, we compare four commonly used protocols for the isolation of recombinant aSyn from Escherichia coli: boiling, acid precipitation, ammonium sulfate precipitation, and periplasmic lysis followed by ion exchange chromatography and gel filtration. We identified, using nondenaturing electrospray ionization mass spectrometry, that aSyn isolated by acid precipitation and periplasmic lysis was the purest and yielded the highest percentage of monomeric protein, 100% and 96.5%, respectively. We then show that aSyn purified by the different protocols exerts different metabolic stresses in cells, with the more multimeric/degraded and least pure samples leading to a larger increase in cell vitality. However, the percentage of monomeric protein and the purity of the samples did not correlate with aSyn aggregation propensity. This study highlights the importance of characterizing monomeric aSyn after purification, as the choice of purification method can significantly influence the outcome of a subsequent study.
中文翻译：
重组 α-突触核蛋白的纯化：常用方案的比较
本质上无序的蛋白质 α-突触核蛋白 (aSyn) 的初始状态，例如，寡聚体和降解产物的存在，或污染物和加合物的存在，可以极大地影响蛋白质的聚集动力学和毒性。在这里，我们比较了四种常用的从大肠杆菌中分离重组 aSyn 的方案：煮沸、酸沉淀、硫酸铵沉淀和周质裂解，然后进行离子交换层析和凝胶过滤。我们使用非变性电喷雾电离质谱法确定，通过酸沉淀和周质裂解分离的 aSyn 是最纯的，产生的单体蛋白百分比最高，分别为 100% 和 96.5%。然后我们表明，通过不同方案纯化的 aSyn 在细胞中施加不同的代谢压力，更多的多聚体/降解和最不纯净的样品导致细胞活力的更大增加。然而，单体蛋白的百分比和样品的纯度与 aSyn 聚集倾向无关。这项研究强调了纯化后表征单体 aSyn 的重要性，
更新日期：2020-12-08
中文翻译：
重组 α-突触核蛋白的纯化：常用方案的比较
本质上无序的蛋白质 α-突触核蛋白 (aSyn) 的初始状态，例如，寡聚体和降解产物的存在，或污染物和加合物的存在，可以极大地影响蛋白质的聚集动力学和毒性。在这里，我们比较了四种常用的从大肠杆菌中分离重组 aSyn 的方案：煮沸、酸沉淀、硫酸铵沉淀和周质裂解，然后进行离子交换层析和凝胶过滤。我们使用非变性电喷雾电离质谱法确定，通过酸沉淀和周质裂解分离的 aSyn 是最纯的，产生的单体蛋白百分比最高，分别为 100% 和 96.5%。然后我们表明，通过不同方案纯化的 aSyn 在细胞中施加不同的代谢压力，更多的多聚体/降解和最不纯净的样品导致细胞活力的更大增加。然而，单体蛋白的百分比和样品的纯度与 aSyn 聚集倾向无关。这项研究强调了纯化后表征单体 aSyn 的重要性，
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