Pathological stimuli cause mitochondrial damage and leakage of mitochondrial DNA (mtDNA) into the cytosol, as demonstrated in many cell types. The cytosolic mtDNA then drives the activation of noninfectious inflammation. Retinal microvascular endothelial cells (RMECs) play an important role in the inner endothelial blood–retinal barrier (BRB). RMEC dysfunction frequently occurs in posterior-segment eye diseases, causing loss of vision. In this study, we investigated the involvement of cytosolic mtDNA in noninfectious immune inflammation in RMECs under pathological stimuli. RMECs were stimulated with 100 ng/ml lipopolysaccharide (LPS), 200 μM hydrogen peroxide (H2O2), or 25 mM d-glucose. After 24 h, immunofluorescent staining was used to detect the opening of the mitochondrial permeability transition pore (MPTP). Cytosolic mtDNA was detected with immunofluorescent staining and PCR after stimulation. mtDNA was then isolated and used to transfect RMECs in vitro, and the protein levels of cGAS were evaluated with western blotting. Real-time PCR was used to examine cGAS mRNA expression levels at different time points after mtDNA stimulation. The activation of STING was detected with immunofluorescent staining 6 h after mtDNA stimulation. Western blotting was used to determine the expression of STING and IFNβ, the phosphorylation status of TBK1, IRF3, and nuclear factor-κB (NF-κB) P65, and the nuclear translocation of IRF3 and NF-κB P65 at 0, 3, 6, 12, and 24 h. The mRNA expression of proinflammatory cytokines CCL4, CXCL10, and IFNB1, and transcription factor IRF1 were determined with real-time PCR, together with the concentrations of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) mRNA. Pathological stimuli caused mtDNA to leak into the cytosol by opening the MPTP in RMECs after 24 h. Cytosolic mtDNA regulated the expression of cGAS and the distribution of STING in RMECs. It promoted ICAM-1, STING and IFNβ expression, TBK1, IRF3, and NF-κB phosphorylation and the nuclear translocation in RMECs at 12 and 24 h after its transfection. The mRNAs of proinflammatory cytokines CCL4, CXCL10, and IFNB1, and transcription factor IRF1 were significantly elevated at 12 and 24 h after mtDNA stimulation. Pathological stimulation induces mtDNA escape into the cytosol of RMECs. This cytoplasmic mtDNA is recognized by the DNA sensor cGAS, increasing the expression of inflammatory cytokines through the STING–TBK1 signaling pathway.

中文翻译：

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线粒体DNA通过视网膜微血管内皮细胞中的cGAS-STING信号通路驱动非经典炎症激活

正如许多细胞类型所证明的那样，病理刺激会导致线粒体损伤和线粒体 DNA (mtDNA) 泄漏到细胞质中。然后细胞质 mtDNA 驱动非感染性炎症的激活。视网膜微血管内皮细胞 (RMEC) 在内皮血-视网膜屏障 (BRB) 中起重要作用。RMEC 功能障碍经常发生在后节眼病中，导致视力丧失。在这项研究中，我们研究了细胞质 mtDNA 在病理刺激下参与 RMEC 的非感染性免疫炎症。RMEC 用 100 ng/ml 脂多糖 (LPS)、200 μM 过氧化氢 (H2O2) 或 25 mM d-葡萄糖刺激。24小时后，免疫荧光染色检测线粒体通透性转换孔（MPTP）的开口。刺激后用免疫荧光染色和PCR检测细胞溶质mtDNA。然后分离出 mtDNA 并用于体外转染 RMEC，并用蛋白质印迹法评估 cGAS 的蛋白质水平。实时 PCR 用于检测 mtDNA 刺激后不同时间点的 cGAS mRNA 表达水平。在 mtDNA 刺激后 6 小时，用免疫荧光染色检测 STING 的激活。Western blotting检测STING和IFNβ的表达，TBK1、IRF3和核因子-κB（NF-κB）P65的磷酸化状态，以及IRF3和NF-κB P65在0、3、6时的核转位、12 和 24 小时。用实时 PCR 测定促炎细胞因子 CCL4、CXCL10 和 IFNB1 的 mRNA 表达，以及转录因子 IRF1，以及细胞间粘附分子 1 (ICAM-1) mRNA 的浓度。病理刺激通过在 24 小时后打开 RMEC 中的 MPTP 导致 mtDNA 泄漏到细胞质中。细胞质 mtDNA 调节 cGAS 的表达和 RMEC 中 STING 的分布。在转染后 12 和 24 小时，它促进 ICAM-1、STING 和 IFNβ 表达、TBK1、IRF3 和 NF-κB 磷酸化以及 RMEC 中的核易位。在 mtDNA 刺激后 12 和 24 小时，促炎细胞因子 CCL4、CXCL10 和 IFNB1 以及转录因子 IRF1 的 mRNA 显着升高。病理刺激诱导 mtDNA 逃逸到 RMECs 的细胞质中。这种细胞质 mtDNA 被 DNA 传感器 cGAS 识别，通过 STING-TBK1 信号通路增加炎症细胞因子的表达。病理刺激通过在 24 小时后打开 RMEC 中的 MPTP 导致 mtDNA 泄漏到细胞质中。细胞质 mtDNA 调节 cGAS 的表达和 RMEC 中 STING 的分布。在转染后 12 和 24 小时，它促进 ICAM-1、STING 和 IFNβ 表达、TBK1、IRF3 和 NF-κB 磷酸化以及 RMEC 中的核易位。在 mtDNA 刺激后 12 和 24 小时，促炎细胞因子 CCL4、CXCL10 和 IFNB1 以及转录因子 IRF1 的 mRNA 显着升高。病理刺激诱导 mtDNA 逃逸到 RMECs 的细胞质中。这种细胞质 mtDNA 被 DNA 传感器 cGAS 识别，通过 STING-TBK1 信号通路增加炎症细胞因子的表达。病理刺激通过在 24 小时后打开 RMEC 中的 MPTP 导致 mtDNA 泄漏到细胞质中。细胞质 mtDNA 调节 cGAS 的表达和 RMEC 中 STING 的分布。在转染后 12 和 24 小时，它促进 ICAM-1、STING 和 IFNβ 表达、TBK1、IRF3 和 NF-κB 磷酸化以及 RMEC 中的核易位。在 mtDNA 刺激后 12 和 24 小时，促炎细胞因子 CCL4、CXCL10 和 IFNB1 以及转录因子 IRF1 的 mRNA 显着升高。病理刺激诱导 mtDNA 逃逸到 RMECs 的细胞质中。这种细胞质 mtDNA 被 DNA 传感器 cGAS 识别，通过 STING-TBK1 信号通路增加炎症细胞因子的表达。细胞质 mtDNA 调节 cGAS 的表达和 RMEC 中 STING 的分布。在转染后 12 和 24 小时，它促进 ICAM-1、STING 和 IFNβ 表达、TBK1、IRF3 和 NF-κB 磷酸化以及 RMEC 中的核易位。在 mtDNA 刺激后 12 和 24 小时，促炎细胞因子 CCL4、CXCL10 和 IFNB1 以及转录因子 IRF1 的 mRNA 显着升高。病理刺激诱导 mtDNA 逃逸到 RMECs 的细胞质中。这种细胞质 mtDNA 被 DNA 传感器 cGAS 识别，通过 STING-TBK1 信号通路增加炎症细胞因子的表达。细胞质 mtDNA 调节 cGAS 的表达和 RMEC 中 STING 的分布。在转染后 12 和 24 小时，它促进 ICAM-1、STING 和 IFNβ 表达、TBK1、IRF3 和 NF-κB 磷酸化以及 RMEC 中的核易位。在 mtDNA 刺激后 12 和 24 小时，促炎细胞因子 CCL4、CXCL10 和 IFNB1 以及转录因子 IRF1 的 mRNA 显着升高。病理刺激诱导 mtDNA 逃逸到 RMECs 的细胞质中。这种细胞质 mtDNA 被 DNA 传感器 cGAS 识别，通过 STING-TBK1 信号通路增加炎症细胞因子的表达。转染后 12 和 24 小时，RMECs 中的 NF-κB 磷酸化和核易位。在 mtDNA 刺激后 12 和 24 小时，促炎细胞因子 CCL4、CXCL10 和 IFNB1 以及转录因子 IRF1 的 mRNA 显着升高。病理刺激诱导 mtDNA 逃逸到 RMECs 的细胞质中。这种细胞质 mtDNA 被 DNA 传感器 cGAS 识别，通过 STING-TBK1 信号通路增加炎症细胞因子的表达。转染后 12 和 24 小时，RMECs 中的 NF-κB 磷酸化和核易位。在 mtDNA 刺激后 12 和 24 小时，促炎细胞因子 CCL4、CXCL10 和 IFNB1 以及转录因子 IRF1 的 mRNA 显着升高。病理刺激诱导 mtDNA 逃逸到 RMECs 的细胞质中。这种细胞质 mtDNA 被 DNA 传感器 cGAS 识别，通过 STING-TBK1 信号通路增加炎症细胞因子的表达。