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A mini‐Tn5‐derived transposon with reportable and selectable markers enables rapid generation and screening of insertional mutants in Gram‐negative bacteria
Letters in Applied Microbiology ( IF 2.0 ) Pub Date : 2020-11-18 , DOI: 10.1111/lam.13423 E.S. Nazareno 1 , B. Acharya 2 , C.K. Dumenyo 2
Letters in Applied Microbiology ( IF 2.0 ) Pub Date : 2020-11-18 , DOI: 10.1111/lam.13423 E.S. Nazareno 1 , B. Acharya 2 , C.K. Dumenyo 2
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We re-engineered a classic tool for mutagenesis and gene expression studies in Gram-negative bacteria. Our modified Tn5-based transposon contains multiple features that allow rapid selection for mutants, direct quantification of gene expression, and straightforward cloning of the inactivated gene. The promoter-less gfp-km cassette provides selection and reporter assay depending on the activity of the promoter upstream of the transposon insertion site. The cat gene facilitates positive antibiotic selection for mutants, while the narrow R6Kγ replication origin forces transposition in recipient strains lacking the pir gene and enables cloning the transposon flanked with the disrupted gene from the chromosome. The suicide vector pCKD100, a plasmid that could be delivered into recipient cells through bi-parental mating or electroporation, harbors the modified transposon. We used the transposon to mutagenize Pectobacterium versatile KD100, Pseudumonas coronafaciens PC27R, and Escherichia coli 35150N. The fluorescence intensities of mutants expressing high GFP could be quantified and detected qualitatively. Transformation efficiency from conjugation ranged from 1600 to 1900 CFU ml-1 . We sequenced the upstream flanking regions, identified the putative truncated genes, and demonstrated the restoration of the GFP phenotype through marker exchange. The mini-Tn5 transposon was also utilized to construct mutant library of P. versatile for forward genetic screens.
中文翻译：
具有可报告和可选择标记的 mini-Tn5 衍生转座子能够快速生成和筛选革兰氏阴性菌中的插入突变体
我们重新设计了用于革兰氏阴性菌诱变和基因表达研究的经典工具。我们改进的基于 Tn5 的转座子包含多种功能，可以快速选择突变体、直接量化基因表达以及直接克隆灭活基因。无启动子的 gfp-km 盒根据转座子插入位点上游启动子的活性提供选择和报告基因检测。cat 基因促进了突变体的抗生素阳性选择，而狭窄的 R6Kγ 复制起点强制在缺乏 pir 基因的受体菌株中进行转座，并能够从染色体中克隆侧翼被破坏的基因的转座子。自杀载体 pCKD100，一种可以通过双亲交配或电穿孔传递到受体细胞中的质粒，携带修饰的转座子。我们使用转座子诱变多用途多效果杆菌 KD100、冠状假单胞菌 PC27R 和大肠杆菌 35150N。可以定量和定性检测表达高 GFP 的突变体的荧光强度。缀合的转化效率范围为 1600 至 1900 CFU ml-1。我们对上游侧翼区域进行了测序，确定了推定的截短基因，并通过标记交换证明了 GFP 表型的恢复。还利用 mini-Tn5 转座子构建了多用途的 P. 突变文库，用于正向遗传筛选。可以定量和定性检测表达高 GFP 的突变体的荧光强度。缀合的转化效率范围为 1600 至 1900 CFU ml-1。我们对上游侧翼区域进行了测序，确定了推定的截短基因，并通过标记交换证明了 GFP 表型的恢复。还利用 mini-Tn5 转座子构建了多用途的 P. 突变文库，用于正向遗传筛选。可以定量和定性检测表达高 GFP 的突变体的荧光强度。缀合的转化效率范围为 1600 至 1900 CFU ml-1。我们对上游侧翼区域进行了测序，确定了推定的截短基因，并通过标记交换证明了 GFP 表型的恢复。还利用 mini-Tn5 转座子构建了用于正向遗传筛选的多功能 P. 突变文库。
更新日期：2020-11-18
中文翻译：
具有可报告和可选择标记的 mini-Tn5 衍生转座子能够快速生成和筛选革兰氏阴性菌中的插入突变体
我们重新设计了用于革兰氏阴性菌诱变和基因表达研究的经典工具。我们改进的基于 Tn5 的转座子包含多种功能，可以快速选择突变体、直接量化基因表达以及直接克隆灭活基因。无启动子的 gfp-km 盒根据转座子插入位点上游启动子的活性提供选择和报告基因检测。cat 基因促进了突变体的抗生素阳性选择，而狭窄的 R6Kγ 复制起点强制在缺乏 pir 基因的受体菌株中进行转座，并能够从染色体中克隆侧翼被破坏的基因的转座子。自杀载体 pCKD100，一种可以通过双亲交配或电穿孔传递到受体细胞中的质粒，携带修饰的转座子。我们使用转座子诱变多用途多效果杆菌 KD100、冠状假单胞菌 PC27R 和大肠杆菌 35150N。可以定量和定性检测表达高 GFP 的突变体的荧光强度。缀合的转化效率范围为 1600 至 1900 CFU ml-1。我们对上游侧翼区域进行了测序，确定了推定的截短基因，并通过标记交换证明了 GFP 表型的恢复。还利用 mini-Tn5 转座子构建了多用途的 P. 突变文库，用于正向遗传筛选。可以定量和定性检测表达高 GFP 的突变体的荧光强度。缀合的转化效率范围为 1600 至 1900 CFU ml-1。我们对上游侧翼区域进行了测序，确定了推定的截短基因，并通过标记交换证明了 GFP 表型的恢复。还利用 mini-Tn5 转座子构建了多用途的 P. 突变文库，用于正向遗传筛选。可以定量和定性检测表达高 GFP 的突变体的荧光强度。缀合的转化效率范围为 1600 至 1900 CFU ml-1。我们对上游侧翼区域进行了测序，确定了推定的截短基因，并通过标记交换证明了 GFP 表型的恢复。还利用 mini-Tn5 转座子构建了用于正向遗传筛选的多功能 P. 突变文库。
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