Elevated column temperature represents a simple means for improving chromatographic separation of peptides. Here, we demonstrated the advantages of the column temperature in peptide separation using state-of-the-art columns. More importantly, we also determined how temperature can impair proteomic bottom-up analyses. We found that an elevated temperature in combination with the acidic pH of the mobile phase induced in-column peptide hydrolysis with high specificity to Asp and accelerated five modification reactions of amino acids. The positive effects of temperature dominated in the 30 min long gradients since the column operated at 90 °C provided the largest number of identified peptides and proteins. However, the adverse effects of temperature on peptide integrity in longer liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) analyses required its reduction to obtain optimum results. The largest number of peptides was identified using the column maintained at 75 °C in 60 min long gradients, at 60 °C in 120 min long gradients, and at 45 °C in 240 min long gradients. Our results indicate that no universal column temperature exists for bottom-up LC–MS analyses. Quite the contrary, the temperature setting must be selected rationally to exploit the full capabilities of the state-of-the-art mass spectrometers in proteomic LC–MS analyses, with the gradient time being a critical factor.

中文翻译：

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蛋白质组学自下而上LC-MS分析中色谱柱温度升高的有意义和无意义

柱温升高是改善肽色谱分离的一种简单方法。在这里，我们展示了使用最先进的色谱柱在肽分离中柱温的优势。更重要的是，我们还确定了温度如何影响蛋白质组学自下而上的分析。我们发现，升高的温度与流动相的酸性pH结合可引起对Asp具有高度特异性的柱内肽水解，并加速了氨基酸的五个修饰反应。自从色谱柱在90°C下运行以来，温度的积极影响在30分钟长的梯度中占主导地位，提供了最大数量的鉴定出的肽和蛋白质。然而，在较长的液相色谱-质谱（LC-MS）分析中，温度对肽完整性的不利影响需要降低以获得最佳结果。使用维持在75°C，60分钟长的梯度，保持在60°C，120分钟长的梯度和在45°C的240分钟长的梯度的色谱柱，可以鉴定到最大数量的肽。我们的结果表明，对于自下而上的LC-MS分析，不存在通用柱温。恰恰相反，必须合理选择温度设置，以充分利用蛋白质组学LC-MS分析中最新质谱仪的全部功能，其中梯度时间是一个关键因素。并在45°C下以240分钟的长梯度洗脱。我们的结果表明，对于自下而上的LC-MS分析，不存在通用柱温。恰恰相反，必须合理选择温度设置，以充分利用蛋白质组学LC-MS分析中最新质谱仪的全部功能，其中梯度时间是一个关键因素。并在45°C下以240分钟的长梯度洗脱。我们的结果表明，对于自下而上的LC-MS分析，不存在通用柱温。恰恰相反，必须合理选择温度设置，以充分利用蛋白质组学LC-MS分析中最新质谱仪的全部功能，其中梯度时间是一个关键因素。