The aim of this study is to set up a standardized and reproducible method to determine the potency (= stem cell content) of human conjunctival cell cultures by means of immunofluorescence-based analyses. This will help the development of new Advanced Therapy Medicinal Products (ATMPs) to use in future cell therapy clinical studies when fewer cells are available to perform the quality controls. To achieve this purpose, a reference standard was investigated and the expression levels of ΔNp63α (considered as a marker of conjunctival stem cells) was correlated to cell size. The limbal hTERT cells were used as reference standard to define the expression value of ΔNp63α. The mean intensity value of limbal hTERT cells ranging between 15 and 20 µm in diameter was used to distinguish between ΔNp63α bright and not bright cells. As ΔNp63α bright expression was mainly seen in the smaller cell size group (10–15 µm), we defined as conjunctival stem cells (= potency) those cells which were bright and with sizes between 10 and 15 µm. Assays on cells from clonal analyses were used to validate the method, as they do allow to observe a decrease in potency (Holoclones > Meroclones > Paraclones). The stem cell content of conjunctival grafts was found to be 11.3% ± 5.0 compared to 21.9% ± 0.6, 9.0% ± 8.1 and 0% from Holoclones, Meroclones and Paraclones, respectively. This new method, here named as Standardized Method for Potency Quantification, will allow to detect the potency in conjunctival cell cultures, thus obtaining a quality control assay responding to the GMP standards required for ATMP release.

本研究的目的是建立一种标准化和可重复的方法，通过基于免疫荧光的分析来确定人类结膜细胞培养物的效力（= 干细胞含量）。这将有助于开发新的高级治疗药物产品 (ATMP)，以便在可用于执行质量控制的细胞较少时用于未来的细胞治疗临床研究。为了达到这个目的，研究了一个参考标准，ΔNp63α（被认为是结膜干细胞的标志物）的表达水平与细胞大小相关。角膜缘 hTERT 细胞用作参考标准来定义 ΔNp63α 的表达值。使用直径在 15 到 20 µm 之间的角膜缘 hTERT 细胞的平均强度值来区分 ΔNp63α 亮细胞和不亮细胞。由于 ΔNp63α 明亮表达主要见于较小的细胞尺寸组（10-15 µm），我们将那些明亮且尺寸在 10-15 µm 之间的细胞定义为结膜干细胞（= 效力）。来自克隆分析的细胞检测用于验证该方法，因为它们确实允许观察效力的降低（全克隆 > 克隆克隆 > 平行克隆）。结膜移植物的干细胞含量为 11.3% ± 5.0，而 Holoclones、Merclones 和 Paraclones 的干细胞含量分别为 21.9% ± 0.6、9.0% ± 8.1 和 0%。这种新方法在此称为效价量化的标准化方法，将允许检测结膜细胞培养物中的效价，从而获得符合 ATMP 发布所需的 GMP 标准的质量控制测定。我们将那些明亮且大小在 10 到 15 µm 之间的细胞定义为结膜干细胞（= 效力）。来自克隆分析的细胞检测用于验证该方法，因为它们确实允许观察效力的降低（全克隆 > 克隆克隆 > 平行克隆）。结膜移植物的干细胞含量为 11.3% ± 5.0，而 Holoclones、Merclones 和 Paraclones 的干细胞含量分别为 21.9% ± 0.6、9.0% ± 8.1 和 0%。这种新方法在此称为效价量化的标准化方法，将允许检测结膜细胞培养物中的效价，从而获得符合 ATMP 发布所需的 GMP 标准的质量控制测定。我们将那些明亮且大小在 10 到 15 µm 之间的细胞定义为结膜干细胞（= 效力）。来自克隆分析的细胞检测用于验证该方法，因为它们确实允许观察效力的降低（全克隆 > 克隆克隆 > 平行克隆）。结膜移植物的干细胞含量为 11.3% ± 5.0，而 Holoclones、Merclones 和 Paraclones 的干细胞含量分别为 21.9% ± 0.6、9.0% ± 8.1 和 0%。这种新方法在此称为效价量化的标准化方法，将允许检测结膜细胞培养物中的效价，从而获得符合 ATMP 发布所需的 GMP 标准的质量控制测定。来自克隆分析的细胞检测用于验证该方法，因为它们确实允许观察效力的降低（全克隆 > 克隆克隆 > 平行克隆）。结膜移植物的干细胞含量为 11.3% ± 5.0，而 Holoclones、Merclones 和 Paraclones 的干细胞含量分别为 21.9% ± 0.6、9.0% ± 8.1 和 0%。这种新方法在此称为效价量化的标准化方法，将允许检测结膜细胞培养物中的效价，从而获得符合 ATMP 发布所需的 GMP 标准的质量控制测定。来自克隆分析的细胞检测用于验证该方法，因为它们确实允许观察效力的降低（全克隆 > 克隆克隆 > 平行克隆）。结膜移植物的干细胞含量为 11.3% ± 5.0，而 Holoclones、Merclones 和 Paraclones 的干细胞含量分别为 21.9% ± 0.6、9.0% ± 8.1 和 0%。这种新方法在此称为效价量化的标准化方法，将允许检测结膜细胞培养物中的效价，从而获得符合 ATMP 发布所需的 GMP 标准的质量控制测定。分别。这种新方法在此称为效价量化的标准化方法，将允许检测结膜细胞培养物中的效价，从而获得符合 ATMP 发布所需的 GMP 标准的质量控制测定。分别。这种新方法在此称为效价量化的标准化方法，将允许检测结膜细胞培养物中的效价，从而获得符合 ATMP 发布所需的 GMP 标准的质量控制测定。