We describe here a vector construct to establish homogeneous cell populations expressing a recombinant gene of interest (GOI) at tuneable levels, including low expression levels that are difficult to generate using standard cell line development techniques. This is achieved using a tricistronic mRNA that contains an open reading frame for the gene of interest, a first internal ribosome entry site (IRES), an open reading frame for a fluorescent reporter protein (such as green fluorescent protein, GFP), a second IRES and an open reading for an antibiotic resistance gene (such as puromycin N-acetyl-transferase, PAC). The resistance gene allows convenient selection of stable cell populations. The fluorescent reporter protein allows convenient homogeneity and expression stability assessments of the cell line. The expression level of the GOI can be adjusted by using different start codons for the open reading frame. These alternate start codons will initiate the translation of the GOI with different efficiency, leading to cell populations expressing different levels of the GOI, and similar levels of the fluorescent reporter through the first IRES and the puromycin resistance gene through the second IRES to the GOI. Such cell populations are useful tools, for instance to assess the safety of potent targeted therapeutics, as they allow the simplified generations of homogenous cell populations with different levels of target protein expression between populations.

我们在此描述了一种载体构建体，以建立在可调水平上表达重组目标基因 (GOI) 的同质细胞群，包括使用标准细胞系开发技术难以生成的低表达水平。这是使用三顺反子 mRNA 实现的，该 mRNA 包含感兴趣基因的开放阅读框、第一个内部核糖体进入位点 (IRES)、一个荧光报告蛋白（如绿色荧光蛋白、GFP）的开放阅读框、第二个IRES 和抗生素抗性基因（如嘌呤霉素 N-乙酰转移酶，PAC）的开放阅读。抗性基因允许方便地选择稳定的细胞群。荧光报告蛋白可以方便地评估细胞系的均匀性和表达稳定性。GOI 的表达水平可以通过对开放阅读框使用不同的起始密码子来调整。这些替代的起始密码子将以不同的效率启动 GOI 的翻译，导致细胞群表达不同水平的 GOI，并且通过第一个 IRES 和通过第二个 IRES 到 GOI 的嘌呤霉素抗性基因表达相似水平的荧光报告基因。此类细胞群是有用的工具，例如用于评估有效靶向治疗的安全性，因为它们允许简化世代之间具有不同目标蛋白表达水平的同质细胞群。导致细胞群表达不同水平的 GOI，以及通过第一个 IRES 表达相似水平的荧光报告基因和通过第二个 IRES 表达到 GOI 的嘌呤霉素抗性基因。此类细胞群是有用的工具，例如用于评估有效靶向治疗的安全性，因为它们允许在群体之间具有不同水平的靶蛋白表达的同质细胞群的简化世代。导致细胞群表达不同水平的 GOI，以及通过第一个 IRES 表达相似水平的荧光报告基因和通过第二个 IRES 表达到 GOI 的嘌呤霉素抗性基因。此类细胞群是有用的工具，例如用于评估有效靶向治疗的安全性，因为它们允许简化世代之间具有不同目标蛋白表达水平的同质细胞群。