ABSTRACT

Our previous studies reveal a mechanism for lipid droplet (LD)-mediated proteostasis in the endoplasmic reticulum (ER) whereby unfolded proteins that accumulate in the ER in response to lipid imbalance-induced ER stress are removed by LDs and degraded by microlipophagy (µLP), autophagosome-independent LD uptake into the vacuole (the yeast lysosome). Here, we show that dithiothreitol- or tunicamycin-induced ER stress also induces µLP and identify an unexpected role for vacuolar membrane dynamics in this process. All stressors studied induce vacuolar fragmentation prior to µLP. Moreover, during µLP, fragmented vacuoles fuse to form cup-shaped structures that encapsulate and ultimately take up LDs. Our studies also indicate that proteins of the endosome sorting complexes required for transport (ESCRT) are upregulated, required for µLP, and recruited to LDs, vacuolar membranes, and sites of vacuolar membrane scission during µLP. We identify possible target proteins for LD-mediated ER proteostasis. Our live-cell imaging studies reveal that one potential target (Nup159) localizes to punctate structures that colocalizes with LDs 1) during movement from ER membranes to the cytosol, 2) during microautophagic uptake into vacuoles, and 3) within the vacuolar lumen. Finally, we find that mutations that inhibit LD biogenesis, homotypic vacuolar membrane fusion or ESCRT function inhibit stress-induced autophagy of Nup159 and other ER proteins. Thus, we have obtained the first direct evidence that LDs and µLP can mediate ER stress-induced ER proteostasis, and identified direct roles for ESCRT and vacuolar membrane fusion in that process.

摘要

我们之前的研究揭示了脂滴 (LD) 介导的内质网 (ER) 蛋白稳态的机制，即在内质网 (ER) 中积累的未折叠蛋白质响应脂质失衡诱导的 ER 应激被 LD 去除并被微脂吞噬 (µLP) 降解，不依赖自噬体的 LD 摄取到液泡（酵母溶酶体）中。在这里，我们表明二硫苏糖醇或衣霉素诱导的 ER 应激也诱导了 µLP，并确定了液泡膜动力学在该过程中的意外作用。所有研究的压力源都会在 µLP 之前诱导液泡碎裂。此外，在 µLP 期间，碎片化的液泡融合形成杯形结构，封装并最终占据 LD。我们的研究还表明，运输所需的内体分选复合物 (ESCRT) 的蛋白质被上调，是 µLP 所必需的，并被招募到 LD、液泡膜和 μLP 期间液泡膜断裂的部位。我们确定了 LD 介导的 ER 蛋白质稳态的可能靶蛋白。我们的活细胞成像研究表明，一个潜在的靶标 (Nup159) 定位于与 LD 共定位的点状结构 1) 在从 ER 膜移动到胞质溶胶期间，2) 在微自噬吸收到液泡期间，以及 3) 在液泡腔内。最后，我们发现抑制 LD 生物发生、同型液泡膜融合或 ESCRT 功能的突变抑制了应激诱导的 Nup159 和其他 ER 蛋白的自噬。因此，我们获得了第一个直接证据表明 LDs 和 µLP 可以介导 ER 应激诱导的 ER 蛋白稳态，并确定了 ESCRT 和液泡膜融合在该过程中的直接作用。和在µLP 期间液泡膜断裂的部位。我们确定了 LD 介导的 ER 蛋白质稳态的可能靶蛋白。我们的活细胞成像研究表明，一个潜在的靶标 (Nup159) 定位于与 LD 共定位的点状结构 1) 在从 ER 膜移动到胞质溶胶期间，2) 在微自噬吸收到液泡期间，以及 3) 在液泡腔内。最后，我们发现抑制 LD 生物发生、同型液泡膜融合或 ESCRT 功能的突变抑制了应激诱导的 Nup159 和其他 ER 蛋白的自噬。因此，我们获得了第一个直接证据表明 LDs 和 µLP 可以介导 ER 应激诱导的 ER 蛋白稳态，并确定了 ESCRT 和液泡膜融合在该过程中的直接作用。和在µLP 期间液泡膜断裂的部位。我们确定了 LD 介导的 ER 蛋白质稳态的可能靶蛋白。我们的活细胞成像研究表明，一个潜在的靶标 (Nup159) 定位于与 LD 共定位的点状结构 1) 在从 ER 膜移动到胞质溶胶期间，2) 在微自噬吸收到液泡期间，以及 3) 在液泡腔内。最后，我们发现抑制 LD 生物发生、同型液泡膜融合或 ESCRT 功能的突变抑制了应激诱导的 Nup159 和其他 ER 蛋白的自噬。因此，我们获得了第一个直接证据表明 LDs 和 µLP 可以介导 ER 应激诱导的 ER 蛋白稳态，并确定了 ESCRT 和液泡膜融合在该过程中的直接作用。我们的活细胞成像研究表明，一个潜在的靶标 (Nup159) 定位于与 LD 共定位的点状结构 1) 在从 ER 膜移动到胞质溶胶期间，2) 在微自噬吸收到液泡期间，以及 3) 在液泡腔内。最后，我们发现抑制 LD 生物发生、同型液泡膜融合或 ESCRT 功能的突变抑制了应激诱导的 Nup159 和其他 ER 蛋白的自噬。因此，我们获得了第一个直接证据表明 LDs 和 µLP 可以介导 ER 应激诱导的 ER 蛋白稳态，并确定了 ESCRT 和液泡膜融合在该过程中的直接作用。我们的活细胞成像研究表明，一个潜在的靶标 (Nup159) 定位于与 LD 共定位的点状结构 1) 在从 ER 膜移动到胞质溶胶期间，2) 在微自噬吸收到液泡期间，以及 3) 在液泡腔内。最后，我们发现抑制 LD 生物发生、同型液泡膜融合或 ESCRT 功能的突变抑制了应激诱导的 Nup159 和其他 ER 蛋白的自噬。因此，我们获得了第一个直接证据表明 LDs 和 µLP 可以介导 ER 应激诱导的 ER 蛋白稳态，并确定了 ESCRT 和液泡膜融合在该过程中的直接作用。2）在微自噬吸收到液泡中的过程中，以及 3）在液泡腔内。最后，我们发现抑制 LD 生物发生、同型液泡膜融合或 ESCRT 功能的突变抑制了应激诱导的 Nup159 和其他 ER 蛋白的自噬。因此，我们获得了第一个直接证据表明 LDs 和 µLP 可以介导 ER 应激诱导的 ER 蛋白稳态，并确定了 ESCRT 和液泡膜融合在该过程中的直接作用。2）在微自噬吸收到液泡中的过程中，以及 3）在液泡腔内。最后，我们发现抑制 LD 生物发生、同型液泡膜融合或 ESCRT 功能的突变抑制了应激诱导的 Nup159 和其他 ER 蛋白的自噬。因此，我们获得了第一个直接证据表明 LDs 和 µLP 可以介导 ER 应激诱导的 ER 蛋白稳态，并确定了 ESCRT 和液泡膜融合在该过程中的直接作用。