High-throughput 16S rRNA gene amplicon sequencing is an essential method for studying the diversity and dynamics of microbial communities. However, this method is presently hampered by the lack of high-identity reference sequences for many environmental microbes in the public 16S rRNA gene reference databases and by the absence of a systematic and comprehensive taxonomy for the uncultured majority. Here, we demonstrate how high-throughput synthetic long-read sequencing can be applied to create ecosystem-specific full-length 16S rRNA gene amplicon sequence variant (FL-ASV) resolved reference databases that include high-identity references (>98.7% identity) for nearly all abundant bacteria (>0.01% relative abundance) using Danish wastewater treatment systems and anaerobic digesters as an example. In addition, we introduce a novel sequence identity-based approach for automated taxonomy assignment (AutoTax) that provides a complete seven-rank taxonomy for all reference sequences, using the SILVA taxonomy as a backbone, with stable placeholder names for unclassified taxa. The FL-ASVs are perfectly suited for the evaluation of taxonomic resolution and bias associated with primers commonly used for amplicon sequencing, allowing researchers to choose those that are ideal for their ecosystem. Reference databases processed with AutoTax greatly improves the classification of short-read 16S rRNA ASVs at the genus- and species-level, compared with the commonly used universal reference databases. Importantly, the placeholder names provide a way to explore the unclassified environmental taxa at different taxonomic ranks, which in combination with in situ analyses can be used to uncover their ecological roles.

中文翻译：

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通过高通量全长16S rRNA基因测序和自动分类法分配（AutoTax），生成具有物种级分辨率的综合生态系统特定参考数据库。

高通量16S rRNA基因扩增子测序是研究微生物群落多样性和动力学的重要方法。但是，由于缺乏公开的16S rRNA基因参考数据库中许多环境微生物的高同一性参考序列，以及缺乏针对未培养多数的系统和全面分类法，该方法目前受到阻碍。在这里，我们演示了如何将高通量合成长读测序技术应用于创建生态系统特定的全长16S rRNA基因扩增子序列变体（FL-ASV）解析的参考数据库，其中包括高同一性参考（> 98.7％的同一性）以丹麦废水处理系统和厌氧消化池为例，对几乎所有丰富细菌（相对丰度> 0.01％）进行分析。此外，我们介绍了一种基于序列身份的新颖方法，用于自动分类法分配（AutoTax），该方法使用SILVA分类法作为主干为所有参考序列提供完整的七级分类法，并为未分类的分类单元提供稳定的占位符名称。FL-ASV非常适合评估与通常用于扩增子测序的引物相关的分类学分辨率和偏差，使研究人员可以选择最适合其生态系统的引物。与常用的通用参考数据库相比，使用AutoTax处理的参考数据库在属类和物种级别上大大改善了短读16S rRNA ASV的分类。重要的是，占位符名称提供了一种探索不同分类等级的未分类环境分类的方法，该方法与 使用SILVA分类法作为骨干，并为未分类的分类单元使用稳定的占位符名称。FL-ASV非常适合评估与通常用于扩增子测序的引物相关的分类学分辨率和偏差，使研究人员可以选择最适合其生态系统的引物。与常用的通用参考数据库相比，使用AutoTax处理的参考数据库在属类和物种级别上大大改善了短读16S rRNA ASV的分类。重要的是，占位符名称提供了一种探索不同分类等级的未分类环境分类的方法，该方法与 使用SILVA分类法作为骨干，并为未分类的分类单元使用稳定的占位符名称。FL-ASV非常适合评估与通常用于扩增子测序的引物相关的分类学分辨率和偏差，使研究人员可以选择最适合其生态系统的引物。与常用的通用参考数据库相比，使用AutoTax处理的参考数据库在属类和物种级别上大大改善了短读16S rRNA ASV的分类。重要的是，占位符名称提供了一种探索不同分类等级的未分类环境分类的方法，该方法与 FL-ASV非常适合评估与通常用于扩增子测序的引物相关的分类学分辨率和偏差，使研究人员可以选择最适合其生态系统的引物。与常用的通用参考数据库相比，使用AutoTax处理的参考数据库在属类和物种级别上大大改善了短读16S rRNA ASV的分类。重要的是，占位符名称提供了一种探索不同分类等级的未分类环境分类的方法，该方法与 FL-ASV非常适合评估与通常用于扩增子测序的引物相关的分类学分辨率和偏差，使研究人员可以选择最适合其生态系统的引物。与常用的通用参考数据库相比，使用AutoTax处理的参考数据库在属类和物种级别上大大改善了短读16S rRNA ASV的分类。重要的是，占位符名称提供了一种探索不同分类等级的未分类环境分类的方法，该方法与 与常用的通用参考数据库相比。重要的是，占位符名称提供了一种探索不同分类等级的未分类环境分类的方法，该方法与 与常用的通用参考数据库相比。重要的是，占位符名称提供了一种探索不同分类等级的未分类环境分类的方法，该方法与原位分析可用于揭示其生态作用。