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Using Eukaryotic Expression Systems to Generate Human α1,3-Fucosyltransferases That Effectively Create Selectin-Binding Glycans on Stem Cells.
Biochemistry ( IF 2.9 ) Pub Date : 2020-09-09 , DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00523 Asma S Al-Amoodi 1 , Kosuke Sakashita 1 , Amal J Ali 1 , Ruoyu Zhou 2 , Jae Man Lee 2 , Muhammad Tehseen 3 , Mo Li 4 , Juan Carlos I Belmonte 5 , Takahiro Kusakabe 2 , Jasmeen S Merzaban 1
Biochemistry ( IF 2.9 ) Pub Date : 2020-09-09 , DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00523 Asma S Al-Amoodi 1 , Kosuke Sakashita 1 , Amal J Ali 1 , Ruoyu Zhou 2 , Jae Man Lee 2 , Muhammad Tehseen 3 , Mo Li 4 , Juan Carlos I Belmonte 5 , Takahiro Kusakabe 2 , Jasmeen S Merzaban 1
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Recruitment of circulating cells toward target sites is primarily dependent on selectin/ligand adhesive interactions. Glycosyltransferases are involved in the creation of selectin ligands on proteins and lipids. α1,3-Fucosylation is imperative for the creation of selectin ligands, and a number of fucosyltransferases (FTs) can modify terminal lactosamines on cells to create these ligands. One FT, fucosyltransferase VI (FTVI), adds a fucose in an α1,3 configuration to N-acetylglucosamine to generate sialyl Lewis X (sLex) epitopes on proteins of live cells and enhances their ability to bind E-selectin. Although a number of recombinant human FTVIs have been purified, apart from limited commercial enzymes, they were not characterized for their activity on live cells. Here we focused on establishing a robust method for producing FTVI that is active on living cells (hematopoietic cells and mesenchymal stromal cells). To this end, we used two expression systems, Bombyx mori (silkworm) and Pichia pastoris (yeast), to produce significant amounts of N-terminally tagged FTVI and demonstrated that these enzymes have superior activity when compared to currently available commercial enzymes that are produced from various expression systems. Overall, we outline a scheme for obtaining large amounts of highly active FTVI that can be used for the application of FTVI in enhancing the engraftment of cells lacking the sLex epitopes.
中文翻译：
使用真核表达系统生成有效地在干细胞上产生与选择素结合的聚糖的人α1,3-岩藻糖基转移酶。
循环细胞向靶位点的募集主要取决于选择素/配体之间的相互作用。糖基转移酶参与蛋白质和脂质上选择素配体的产生。α1,3-岩藻糖基化对于选择素配体的创建是必不可少的，许多岩藻糖基转移酶（FTs）可以修饰细胞上的末端乳糖胺以创建这些配体。一种FT，岩藻糖基转移酶VI（FTVI），将α1,3构型的岩藻糖添加到N-乙酰氨基葡萄糖中，生成唾液酸化的Lewis X（sLe x）活细胞蛋白质上的表位，并增强它们结合E-选择素的能力。尽管已经纯化了许多重组人FTVI，除了有限的商业酶外，还没有表征它们对活细胞的活性。在这里，我们专注于建立一种在活细胞（造血细胞和间质基质细胞）上有活性的生产FTVI的可靠方法。为此，我们使用了两种表达系统，家蚕（Bombyx mori）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。（酵母），以产生大量的N末端标记的FTVI，并证明与目前从各种表达系统生产的市售酶相比，这些酶具有更高的活性。总体而言，我们概述了获得大量高活性FTVI的方案，该方案可用于FTVI在增强缺乏sLe x表位的细胞的植入中的应用。
更新日期：2020-10-06
中文翻译：
使用真核表达系统生成有效地在干细胞上产生与选择素结合的聚糖的人α1,3-岩藻糖基转移酶。
循环细胞向靶位点的募集主要取决于选择素/配体之间的相互作用。糖基转移酶参与蛋白质和脂质上选择素配体的产生。α1,3-岩藻糖基化对于选择素配体的创建是必不可少的，许多岩藻糖基转移酶（FTs）可以修饰细胞上的末端乳糖胺以创建这些配体。一种FT，岩藻糖基转移酶VI（FTVI），将α1,3构型的岩藻糖添加到N-乙酰氨基葡萄糖中，生成唾液酸化的Lewis X（sLe x）活细胞蛋白质上的表位，并增强它们结合E-选择素的能力。尽管已经纯化了许多重组人FTVI，除了有限的商业酶外，还没有表征它们对活细胞的活性。在这里，我们专注于建立一种在活细胞（造血细胞和间质基质细胞）上有活性的生产FTVI的可靠方法。为此，我们使用了两种表达系统，家蚕（Bombyx mori）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。（酵母），以产生大量的N末端标记的FTVI，并证明与目前从各种表达系统生产的市售酶相比，这些酶具有更高的活性。总体而言，我们概述了获得大量高活性FTVI的方案，该方案可用于FTVI在增强缺乏sLe x表位的细胞的植入中的应用。
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