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Recombinant expression of an l-amino acid oxidase from the fungus Hebeloma cylindrosporum in Pichia pastoris including fermentation.
MicrobiologyOpen ( IF 3.9 ) Pub Date : 2020-08-27 , DOI: 10.1002/mbo3.1112 Marc Christian Heß 1 , Svenja Bloess 1 , Joe Max Risse 2 , Karl Friehs 2 , Gabriele Fischer von Mollard 1
MicrobiologyOpen ( IF 3.9 ) Pub Date : 2020-08-27 , DOI: 10.1002/mbo3.1112 Marc Christian Heß 1 , Svenja Bloess 1 , Joe Max Risse 2 , Karl Friehs 2 , Gabriele Fischer von Mollard 1
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l‐amino acid oxidases (LAAOs) are flavoenzymes that catalyze the oxidative deamination of l‐amino acids to the corresponding α‐keto acids, ammonia, and hydrogen peroxide. Here, we show the overexpression, purification, and the characterization of LAAO4 from the fungus Hebeloma cylindrosporum in the yeast Pichia pastoris with a 9His‐tag and compare this with the recently characterized 6His‐hcLAAO4 expressed in E. coli. The expression of the enzyme with an ER‐signal sequence in P. pastoris resulted in a glycosylated, secreted protein. The enzymatic activity without activation was higher after expression in P. pastoris compared to E. coli. Due to treatment with acidic pH, a striking increase of activity could be detected for both expression systems resulting in similar specific activities after acid activation. Regarding the substrate spectrum, temperature stability, Km, and vmax values, hcLAAO4 showed very few differences when produced in these two expression systems. A higher yield of hcLAAO4 could be obtained by fermentation.
中文翻译：
巴斯德毕赤氏酵母中的一种真菌Hebeloma cylindrosporum中的l-氨基酸氧化酶的重组表达，包括发酵。
l氨基酸氧化酶（LAAO）是黄素酶，可催化l氨基酸氧化为相应的α-酮酸，氨和过氧化氢。在这里，我们显示了带有9His标签的酵母毕赤酵母中的真菌Hebeloma cylindrosporum的真菌中的LAAO4的过表达，纯化和表征，并将其与E中表达的最近鉴定的6His- hc LAAO4进行了比较。大肠杆菌。带有ER信号序列的酶在P中的表达。 巴斯德氏菌产生糖基化的分泌蛋白。在P中表达后没有激活的酶活性较高。。 毕赤酵母相比Ë。大肠杆菌。由于用酸性pH处理，可以检测到两种表达系统的活性显着增加，从而在酸活化后导致相似的比活性。关于底物光谱，温度稳定性，K m和v max值，在这两个表达系统中产生的hc LAAO4差异很小。通过发酵可以获得较高的hc LAAO4产量。
更新日期：2020-10-17
中文翻译：
巴斯德毕赤氏酵母中的一种真菌Hebeloma cylindrosporum中的l-氨基酸氧化酶的重组表达，包括发酵。
l氨基酸氧化酶（LAAO）是黄素酶，可催化l氨基酸氧化为相应的α-酮酸，氨和过氧化氢。在这里，我们显示了带有9His标签的酵母毕赤酵母中的真菌Hebeloma cylindrosporum的真菌中的LAAO4的过表达，纯化和表征，并将其与E中表达的最近鉴定的6His- hc LAAO4进行了比较。大肠杆菌。带有ER信号序列的酶在P中的表达。 巴斯德氏菌产生糖基化的分泌蛋白。在P中表达后没有激活的酶活性较高。。 毕赤酵母相比Ë。大肠杆菌。由于用酸性pH处理，可以检测到两种表达系统的活性显着增加，从而在酸活化后导致相似的比活性。关于底物光谱，温度稳定性，K m和v max值，在这两个表达系统中产生的hc LAAO4差异很小。通过发酵可以获得较高的hc LAAO4产量。
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