ABSTRACT

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs about 22-nucleotide (nt) in length that collectively regulate more than 60% of coding genes. Aberrant miRNA expression is associated with numerous diseases, including cancer. miRNA biogenesis is licenced by the ribonuclease (RNase) III enzyme Drosha, the regulation of which is critical in determining miRNA levels. We and others have previously revealed that alternative splicing regulates the subcellular localization of Drosha. To further investigate the alternative splicing landscape of Drosha transcripts, we performed PacBio sequencing in different human cell lines. We identified two novel isoforms resulting from partial intron-retention in the region encoding the Drosha catalytic domain. One isoform (AS27a) generates a truncated protein that is unstable in cells. The other (AS32a) produces a full-length Drosha with a 14 amino acid insertion in the RIIID domain. By taking advantage of Drosha knockout cells in combination with a previously established reporter assay, we demonstrated that Drosha-AS32a lacks cleavage activity. Furthermore, neither Drosha-27a nor Drosha-32a were able to rescue miRNA expression in the Drosha knockout cells. Interestingly, both isoforms were abundantly detected in a wide range of cancer cell lines (up to 15% of all Drosha isoforms). Analysis of the RNA-seq data from over 1000 breast cancer patient samples revealed that the AS32a is relatively more abundant in tumours than in normal tissue, suggesting that AS32a may play a role in cancer development.

摘要

MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为 22 个核苷酸 (nt) 的小型非编码 RNA，它们共同调节 60% 以上的编码基因。异常的 miRNA 表达与许多疾病有关，包括癌症。miRNA 生物发生由核糖核酸酶 (RNase) III 酶 Drosha 许可，其调节对于确定 miRNA 水平至关重要。我们和其他人之前已经揭示了选择性剪接调节 Drosha 的亚细胞定位。为了进一步研究 Drosha 转录本的可变剪接景观，我们在不同的人类细胞系中进行了 PacBio 测序。我们确定了由编码 Drosha 催化域的区域中的部分内含子保留产生的两种新型同种型。一种同工型 (AS27a) 会产生一种在细胞中不稳定的截短蛋白质。另一个 (AS32a) 产生一个全长 Drosha，在 RIIID 结构域中插入了 14 个氨基酸。通过利用 Drosha 敲除细胞与先前建立的报告基因检测相结合，我们证明 Drosha-AS32a 缺乏切割活性。此外，Drosha-27a 和 Drosha-32a 都无法挽救 Drosha 敲除细胞中的 miRNA 表达。有趣的是，在广泛的癌细胞系（高达所有 Drosha 同种型的 15%）中大量检测到这两种同种型。对来自 1000 多个乳腺癌患者样本的 RNA-seq 数据的分析表明，AS32a 在肿瘤中的含量比在正常组织中的丰度要高，这表明 AS32a 可能在癌症发展中起作用。通过利用 Drosha 敲除细胞与先前建立的报告基因检测相结合，我们证明 Drosha-AS32a 缺乏切割活性。此外，Drosha-27a 和 Drosha-32a 都无法挽救 Drosha 敲除细胞中的 miRNA 表达。有趣的是，在广泛的癌细胞系（高达所有 Drosha 同种型的 15%）中大量检测到这两种同种型。对来自 1000 多个乳腺癌患者样本的 RNA-seq 数据的分析表明，AS32a 在肿瘤中的含量比在正常组织中的丰度要高，这表明 AS32a 可能在癌症发展中起作用。通过利用 Drosha 敲除细胞与先前建立的报告基因检测相结合，我们证明 Drosha-AS32a 缺乏切割活性。此外，Drosha-27a 和 Drosha-32a 都无法挽救 Drosha 敲除细胞中的 miRNA 表达。有趣的是，在广泛的癌细胞系（高达所有 Drosha 同种型的 15%）中大量检测到这两种同种型。对来自 1000 多个乳腺癌患者样本的 RNA-seq 数据的分析表明，AS32a 在肿瘤中的含量比在正常组织中的丰度要高，这表明 AS32a 可能在癌症发展中起作用。在广泛的癌细胞系（高达所有 Drosha 同种型的 15%）中大量检测到这两种同种型。对来自 1000 多个乳腺癌患者样本的 RNA-seq 数据的分析表明，AS32a 在肿瘤中的含量比在正常组织中的丰度要高，这表明 AS32a 可能在癌症发展中起作用。在广泛的癌细胞系（高达所有 Drosha 同种型的 15%）中大量检测到这两种同种型。对来自 1000 多个乳腺癌患者样本的 RNA-seq 数据的分析表明，AS32a 在肿瘤中的含量比在正常组织中的丰度要高，这表明 AS32a 可能在癌症发展中起作用。