Endocytosis is a fundamental process occurring in all eukaryotic cells. Live cell imaging of endocytosis has helped to decipher many of its mechanisms and regulations. With the pulsed-pH (ppH) protocol, one can detect the formation of individual endocytic vesicles (EVs) with an unmatched temporal resolution of 2 s. The ppH protocol makes use of cargo protein (e.g., the transferrin receptor) coupled to a pH-sensitive fluorescent protein, such as superecliptic pHluorin (SEP), which is brightly fluorescent at pH 7.4 but not fluorescent at pH <6.0. If the SEP moiety is at the surface, its fluorescence will decrease when cells are exposed to a low pH (5.5) buffer. If the SEP moiety has been internalized, SEP will remain fluorescent even during application of the low pH buffer. Fast perfusion enables the complete exchange of low and high pH extracellular solutions every 2 s, defining the temporal resolution of the technique. Unlike other imaging-based endocytosis assays, the ppH protocol detects EVs without a priori hypotheses on the dynamics of vesicle formation. Here, we explain how the ppH protocol quantifies the endocytic activity of living cells and the recruitment of associated proteins in real time. We provide a step-by-step procedure for expression of the reporter proteins with transient transfection, live cell image acquisition with synchronized pH changes and automated analysis. The whole protocol can be performed in 2 d to provide quantitative information on the endocytic process being studied.

内吞作用是发生在所有真核细胞中的一个基本过程。内吞作用的活细胞成像有助于破译其许多机制和法规。使用脉冲 pH (ppH) 协议，可以检测单个内吞囊泡 (EV) 的形成，时间分辨率为 2 s。ppH 协议利用货物蛋白（例如，转铁蛋白受体）与 pH 敏感荧光蛋白偶联，例如超黄道 pHluorin (SEP)，它在 pH 7.4 时发出明亮的荧光，但在 pH <6.0 时不发出荧光。如果 SEP 部分位于表面，当细胞暴露于低 pH (5.5) 缓冲液时，其荧光会减弱。如果 SEP 部分已被内化，即使在应用低 pH 缓冲液期间，SEP 也会保持荧光。快速灌注能够每 2 秒完全交换低 pH 值和高 pH 值的细胞外溶液，从而定义该技术的时间分辨率。与其他基于成像的内吞作用测定不同，ppH 协议检测 EV，而无需对囊泡形成动力学进行先验假设。在这里，我们解释了 ppH 协议如何实时量化活细胞的内吞活性和相关蛋白的募集。我们通过瞬时转染、同步 pH 值变化和自动分析的活细胞图像采集，提供报告蛋白表达的分步程序。整个协议可以在 2 d 内执行，以提供有关正在研究的内吞过程的定量信息。与其他基于成像的内吞作用测定不同，ppH 协议检测 EV，而无需对囊泡形成动力学进行先验假设。在这里，我们解释了 ppH 协议如何实时量化活细胞的内吞活性和相关蛋白的募集。我们通过瞬时转染、同步 pH 值变化和自动分析的活细胞图像采集，提供报告蛋白表达的分步程序。整个协议可以在 2 d 内执行，以提供有关正在研究的内吞过程的定量信息。与其他基于成像的内吞作用测定不同，ppH 协议检测 EV，而无需对囊泡形成动力学进行先验假设。在这里，我们解释了 ppH 协议如何实时量化活细胞的内吞活性和相关蛋白的募集。我们通过瞬时转染、同步 pH 值变化和自动分析的活细胞图像采集，提供报告蛋白表达的分步程序。整个协议可以在 2 d 内执行，以提供有关正在研究的内吞过程的定量信息。我们通过瞬时转染、同步 pH 值变化和自动分析的活细胞图像采集，提供报告蛋白表达的分步程序。整个协议可以在 2 d 内执行，以提供有关正在研究的内吞过程的定量信息。我们通过瞬时转染、同步 pH 值变化和自动分析的活细胞图像采集，提供报告蛋白表达的分步程序。整个协议可以在 2 d 内执行，以提供有关正在研究的内吞过程的定量信息。