To increase the size of the druggable proteome, it would be highly desirable to devise efficient methods to translocate designed binding proteins to the cytosol, as they could specifically target flat and hydrophobic protein-protein interfaces. If this could be done in a manner dependent on a cell surface receptor, two layers of specificity would be obtained: one for the cell type and the other for the cytosolic target. Bacterial protein toxins have naturally evolved such systems. Anthrax toxin consists of a pore-forming translocation unit (protective antigen (PA)) and a separate protein payload. When engineering PA to ablate binding to its own receptor and instead binding to a receptor of choice, by fusing a designed ankyrin repeat protein (DARPin), uptake in new cell types can be achieved. Prepore-to-pore conversion of redirected PA already occurs at the cell surface, limiting the amount of PA that can be administered and thus limiting the amount of delivered payload. We hypothesized that the reason is a lack of a stabilizing interaction with wild-type PA receptor. We have now reengineered PA to incorporate the binding domain of the anthrax receptor CMG2, followed by a DARPin, binding to the receptor of choice. This construct is indeed stabilized, undergoes prepore-to-pore conversion only in late endosomes, can be administered to much higher concentrations without showing toxicity, and consequently delivers much higher amounts of payload to the cytosol. We believe that this reengineered system is an important step forward to addressing efficient cell-specific delivery of proteins to the cytosol.

中文翻译：

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重新设计炭疽毒素保护性抗原，以改善受体特异性蛋白的递送。

为了增加可药物化蛋白质组的大小，迫切需要设计出有效的方法来将设计的结合蛋白转移到胞质溶胶中，因为它们可以特异性地靶向平坦的和疏水的蛋白-蛋白界面。如果这可以通过依赖于细胞表面受体的方式完成，那么将获得两层特异性：一层针对细胞类型，另一层针对胞质靶标。细菌蛋白毒素已自然进化出这种系统。炭疽毒素由成孔易位单位（保护性抗原（PA））和单独的蛋白质有效载荷组成。通过融合设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin），工程改造PA使其与自身的受体结合而消除与所选受体的结合时，可以实现新细胞类型的吸收。重定向PA的孔前到孔转化已经发生在细胞表面，限制了可施用的PA量，因此限制了所输送有效载荷的量。我们假设其原因是缺乏与野生型PA受体的稳定相互作用。现在，我们已经对PA进行了重新设计，使其整合了炭疽受体CMG2的结合域，随后是DARPin，与所选受体结合。该构建体确实是稳定的，仅在晚期内体中经历了孔前到孔的转化，可以以高得多的浓度施用而没有显示毒性，因此向细胞质中递送了更高量的有效载荷。我们相信，这个经过重新设计的系统是解决蛋白质向细胞质的高效细胞特异性递送的重要一步。限制了可以管理的PA数量，从而限制了所交付的有效负载数量。我们假设其原因是缺乏与野生型PA受体的稳定相互作用。现在，我们已经对PA进行了重新设计，使其整合了炭疽受体CMG2的结合域，随后是DARPin，与所选受体结合。该构建体确实是稳定的，仅在晚期内体中经历了孔前到孔的转化，可以以高得多的浓度施用而没有显示毒性，因此向细胞质中递送了更高量的有效载荷。我们相信，这个经过重新设计的系统是解决蛋白质向细胞质的高效细胞特异性递送的重要一步。限制了可以管理的PA数量，从而限制了所交付的有效负载数量。我们假设其原因是与野生型PA受体缺乏稳定的相互作用。现在，我们已经对PA进行了重新设计，使其整合了炭疽受体CMG2的结合域，随后是DARPin，与所选受体结合。该构建体确实是稳定的，仅在晚期内体中经历了孔前到孔的转化，可以以高得多的浓度给药而没有显示毒性，因此向细胞质中传递了更高量的有效载荷。我们相信，这个经过重新设计的系统是解决蛋白质向细胞质的高效细胞特异性递送的重要一步。我们假设其原因是缺乏与野生型PA受体的稳定相互作用。现在，我们已经对PA进行了重新设计，使其整合了炭疽受体CMG2的结合域，随后是DARPin，与所选受体结合。该构建体确实是稳定的，仅在晚期内体中经历了孔前到孔的转化，可以以高得多的浓度施用而没有显示毒性，因此向细胞质中递送了更高量的有效载荷。我们相信，这个经过重新设计的系统是解决蛋白质向细胞质的高效细胞特异性递送的重要一步。我们假设其原因是缺乏与野生型PA受体的稳定相互作用。现在，我们已经对PA进行了重新设计，使其整合了炭疽受体CMG2的结合域，随后是DARPin，与所选受体结合。该构建体确实是稳定的，仅在晚期内体中经历了孔前到孔的转化，可以以高得多的浓度施用而没有显示毒性，因此向细胞质中递送了更高量的有效载荷。我们相信，这个经过重新设计的系统是解决蛋白质向细胞质的高效细胞特异性递送的重要一步。该构建体确实是稳定的，仅在晚期内体中经历了孔前到孔的转化，可以以高得多的浓度施用而没有显示毒性，因此向细胞质中递送了更高量的有效载荷。我们相信，这个经过重新设计的系统是解决蛋白质向细胞质的高效细胞特异性递送的重要一步。该构建体确实是稳定的，仅在晚期内体中经历了孔前到孔的转化，可以以高得多的浓度施用而没有显示毒性，因此向细胞质中递送了更高量的有效载荷。我们相信，这个经过重新设计的系统是解决蛋白质向细胞质的高效细胞特异性递送的重要一步。