ENaC gating is regulated by phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP₂). The PIP₂-dependent regulation of ENaC is mediated by the myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate-like protein-1 (MLP-1). MLP-1 binds to PIP₂ at the plasma membrane. We examined MLP-1 regulation of ENaC in DCT-15 cells. MLP-1 consists of a positively charged effector domain that sequesters PIP₂ and contains serines that are a PKC targets and controls MLP-1 membrane association; a myristoylation domain promoting membrane association, and a multiple homology 2 domain of unknown function. We constructed several MLP-1 mutants: WT: a full length wild-type protein; S3A: 3 substitutions in the effector domain to prevent phosphorylation; S3D: replaced three serines with aspartates to mimic constitutive phosphorylation; GA: replaced the myristoylation site glycine with alanine so GA could not be myristoylated. Mutants were tagged with N-terminal 3XFLAG or C-terminal m-Cherry or V5. Transfection with MLP mutants modified ENaC activity: S3A activity was highest and S3D lowest; the activity of both was significantly different from WT. In Western blots, when transfected with 3XFLAG tagged MLP-1 mutants, expression of full length MLP-1 at 52 KDa increased in S3A-MLP-1 transfected cells and decreased in S3D-MLP-1 transfected cells. Lower molecular weight bands were detected that correspond to potential protease cleavage products. Confocal imaging shows that mutants localize in different sub-cellular compartments consistent with their preferred location in the membrane or cytosol. Protein kinase C increases phosphorylation of endogenous MLP-1 and reduces ENaC activity. Our results suggest a complicated role for proteolytic processing in MLP-1 regulation of ENaC.

中文翻译：

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肉豆蔻酰化的富含丙氨酸的 C 激酶底物样蛋白 1 调节肾远曲小管细胞的上皮钠通道活性。

ENaC 门控由磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (PIP ₂ )调节。ENaC的 PIP ₂依赖性调节由肉豆蔻酰化富含丙氨酸的蛋白激酶 C 底物样蛋白 1 (MLP-1) 介导。MLP-1在质膜上与 PIP ₂结合。我们检查了 DCT-15 细胞中 ENaC 的 MLP-1 调节。MLP-1 由一个带正电荷的效应结构域组成，可隔离 PIP ₂并含有丝氨酸，它是 PKC 的靶标并控制 MLP-1 膜结合；促进膜结合的豆蔻酰化结构域和未知功能的多重同源 2 结构域。我们构建了几个 MLP-1 突变体： WT：全长野生型蛋白质；S3A：效应结构域中的 3 个取代以防止磷酸化；S3D：用天冬氨酸替代三个丝氨酸以模拟组成型磷酸化；GA：用丙氨酸替换肉豆蔻酰化位点甘氨酸，因此 GA 不能被肉豆蔻酰化。突变体用 N 端 3XFLAG 或 C 端 m-Cherry 或 V5 标记。转染 MLP 突变体改变 ENaC 活性：S3A 活性最高，S3D 最低；两者的活性与WT显着不同。在蛋白质印迹中，当用 3XFLAG 标记的 MLP-1 突变体转染时，全长 MLP-1 在 52 KDa 的表达在 S3A-MLP-1 转染细胞中增加，在 S3D-MLP-1 转染细胞中减少。检测到与潜在蛋白酶切割产物相对应的较低分子量条带。共聚焦成像显示突变体定位在不同的亚细胞区室中，与它们在膜或细胞质中的首选位置一致。蛋白激酶 C 增加内源性 MLP-1 的磷酸化并降低 ENaC 活性。我们的结果表明蛋白水解加工在 ENaC 的 MLP-1 调节中具有复杂的作用。共聚焦成像显示突变体定位在不同的亚细胞区室中，与它们在膜或细胞质中的首选位置一致。蛋白激酶 C 增加内源性 MLP-1 的磷酸化并降低 ENaC 活性。我们的结果表明蛋白水解加工在 ENaC 的 MLP-1 调节中具有复杂的作用。共聚焦成像显示突变体定位在不同的亚细胞区室中，与它们在膜或细胞质中的首选位置一致。蛋白激酶 C 增加内源性 MLP-1 的磷酸化并降低 ENaC 活性。我们的结果表明蛋白水解加工在 ENaC 的 MLP-1 调节中具有复杂的作用。