Failure of cervical insemination with cryopreserved semen is hindering implementation of AI in sheep in field condition. Here the effect of equilibration time and catalase on post-thaw qualities of ram semen was investigated. Pooled semen was diluted (800 × 106 sperm mL-1) with a TES-Tris-fructose extender with 6% glycerol, 15% egg yolk and supplemented with 0, 50, 100 and 200 U mL-1 catalase and packaged into 0.25 mL straws. In experiment 1, straws were equilibrated at 5 °C either for 3 h in a cold cabinet (E3) or for 10 (E10) and 22 h (E22) inside a refrigerator. In experiment 2, all straws were equilibrated for 22 h inside refrigerator. Straws were frozen at -25 °C min-1 up to -125 °C using a cell freezer and finally plunged into liquid nitrogen. The post-thaw total and rapid motility were higher (P < 0.05) in E22 compared to E3 and E10. Sperm kinetics was comparable between E3 and E22, but lower in E10. Similarly, acrosome integrity, functional membrane integrity, percent high cholesterol (mCHO) and live-high mitochondrial membrane potential (MMP) were higher (P < 0.05) while live-high intracellular calcium and acrosome-reacted sperm were lower in E22 compared to E3 and E10. The percent rapid motile, high mCHO and live-high MMP were significantly (P < 0.05) lower in catalase-treated samples compared to the control, while the membrane integrity was comparable within the groups. In conclusion, pre-freezing equilibration for 22 h compared to 3 or 10 h resulted in higher post-thaw sperm functions while catalase had negative impact on cryopreservation of ram semen.

中文翻译：

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预冷冻平衡 22 小时通过减少胆固醇外流来改善冷冻保存的公羊精液中的解冻后精子功能

使用冷冻精液进行宫颈授精的失败阻碍了在野外条件下在绵羊中实施人工授精。这里研究了平衡时间和过氧化氢酶对公羊精液解冻后品质的影响。混合精液用含有 6% 甘油、15% 蛋黄的 TES-Tris-果糖增量剂稀释（800 × 106 精子 mL-1），并补充有 0、50、100 和 200 U mL-1 过氧化氢酶，并包装成 0.25 mL吸管。在实验 1 中，吸管在 5 °C 的冷柜 (E3) 中平衡 3 小时，或在冰箱中平衡 10 (E10) 和 22 小时 (E22)。在实验2中，所有吸管在冰箱内平衡22小时。使用细胞冷冻机将吸管在 -25 °C min-1 至 -125 °C 下冷冻，最后放入液氮中。与 E3 和 E10 相比，E22 中的解冻后总运动性和快速运动性更高（P < 0.05）。E3 和 E22 之间的精子动力学相当，但在 E10 中较低。同样，与 E3 相比，E22 的顶体完整性、功能膜完整性、高胆固醇百分比 (mCHO) 和高活性线粒体膜电位 (MMP) 较高（P < 0.05），而高活性细胞内钙和顶体反应精子较低和 E10。与对照相比，过氧化氢酶处理的样品中快速运动、高 mCHO 和高活性 MMP 的百分比显着降低（P < 0.05），而各组内的膜完整性相当。总之，与 3 小时或 10 小时相比，22 小时的预冷冻平衡导致更高的解冻后精子功能，而过氧化氢酶对公羊精液的冷冻保存有负面影响。与 E3 和 E10 相比，E22 的功能膜完整性、高胆固醇百分比 (mCHO) 和高活性线粒体膜电位 (MMP) 较高（P < 0.05），而高活性细胞内钙和顶体反应精子较低。与对照相比，过氧化氢酶处理的样品中快速运动、高 mCHO 和高活性 MMP 的百分比显着降低（P < 0.05），而各组内的膜完整性相当。总之，与 3 小时或 10 小时相比，22 小时的预冷冻平衡导致更高的解冻后精子功能，而过氧化氢酶对公羊精液的冷冻保存有负面影响。与 E3 和 E10 相比，E22 的功能膜完整性、高胆固醇百分比 (mCHO) 和高活性线粒体膜电位 (MMP) 较高（P < 0.05），而高活性细胞内钙和顶体反应精子较低。与对照相比，过氧化氢酶处理的样品中快速运动、高 mCHO 和高活性 MMP 的百分比显着降低（P < 0.05），而各组内的膜完整性相当。总之，与 3 小时或 10 小时相比，22 小时的预冷冻平衡导致更高的解冻后精子功能，而过氧化氢酶对公羊精液的冷冻保存有负面影响。05) 而与 E3 和 E10 相比，E22 中的活高细胞内钙和顶体反应精子较低。与对照相比，过氧化氢酶处理的样品中快速运动、高 mCHO 和高活性 MMP 的百分比显着降低（P < 0.05），而各组内的膜完整性相当。总之，与 3 小时或 10 小时相比，22 小时的预冷冻平衡导致更高的解冻后精子功能，而过氧化氢酶对公羊精液的冷冻保存有负面影响。05) 而与 E3 和 E10 相比，E22 中的活高细胞内钙和顶体反应精子较低。与对照相比，过氧化氢酶处理的样品中快速运动、高 mCHO 和高活性 MMP 的百分比显着降低（P < 0.05），而各组内的膜完整性相当。总之，与 3 小时或 10 小时相比，22 小时的预冷冻平衡导致更高的解冻后精子功能，而过氧化氢酶对公羊精液的冷冻保存有负面影响。