Measurements of membrane protein thermostability allows indirect detection of ligand binding. Current thermostability assays require protein purification or rely on pre-existing radiolabelled or fluorescent ligands, limiting their application to established target proteins. Alternative methods detect protein aggregation which requires sufficiently high level of protein expression. Here, we present a ThermoBRET method to quantify the relative thermostability of G protein-coupled receptors (GPCRs), using cannabinoid receptors (CB1 and CB2) and the β2-adrenoceptor (β2AR) as model systems. ThermoBRET reports receptor unfolding, does not need labelled ligands and can be used with non-purified proteins. It uses Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) between Nanoluciferase (Nluc) and a thiol-reactive fluorescent dye that binds cysteines exposed by unfolding. We demonstrate that the melting point (Tm) of Nluc-fused GPCRs can be determined in non-purified detergent solubilised membrane preparations or solubilised whole cells, revealing differences in thermostability for different solubilising conditions and in the presence of stabilising ligands. We extended the range of the assay by developing the thermostable tsNLuc by incorporating mutations from the fragments of split-Nluc (Tm of 87 ⁰C vs 59 ⁰C). ThermoBRET allows determination of GPCR thermostability, which is useful for protein purification optimisation and as part of drug discovery screening strategies.

中文翻译：

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ThermoBRET：一种应用于 GPCR 的配体接合纳米级热稳定性测定

膜蛋白热稳定性的测量可以间接检测配体结合。目前的热稳定性测定需要蛋白质纯化或依赖于预先存在的放射性标记或荧光配体，限制了它们对已建立的目标蛋白质的应用。替代方法检测需要足够高水平的蛋白质表达的蛋白质聚集。在这里，我们提出了一种 ThermoBRET 方法，使用大麻素受体（CB1 和 CB2）和 β2-肾上腺素受体（β2AR）作为模型系统来量化 G 蛋白偶联受体（GPCR）的相对热稳定性。ThermoBRET 报告受体去折叠，不需要标记的配体，并且可以与非纯化的蛋白质一起使用。它利用纳米荧光素酶 (Nluc) 和硫醇反应性荧光染料之间的生物发光共振能量转移 (BRET)，该染料与解折叠暴露的半胱氨酸结合。我们证明，Nluc 融合 GPCR 的熔点 (Tm) 可以在未纯化的去污剂溶解的膜制剂或溶解的全细胞中测定，​​揭示了不同溶解条件和稳定配体存在下的热稳定性差异。我们通过整合 split-Nluc 片段的突变（Tm 为 87 ⁰C 与 59 ⁰C）来开发热稳定性 tsNLuc，从而扩展了检测范围。ThermoBRET 可以测定 GPCR 热稳定性，这对于蛋白质纯化优化和作为药物发现筛选策略的一部分很有用。我们证明，Nluc 融合 GPCR 的熔点 (Tm) 可以在未纯化的去污剂溶解的膜制剂或溶解的全细胞中测定，​​揭示了不同溶解条件和稳定配体存在下的热稳定性差异。我们通过整合 split-Nluc 片段的突变（Tm 为 87 ⁰C 与 59 ⁰C）来开发热稳定性 tsNLuc，从而扩展了检测范围。ThermoBRET 可以测定 GPCR 热稳定性，这对于蛋白质纯化优化和作为药物发现筛选策略的一部分很有用。我们证明，Nluc 融合 GPCR 的熔点 (Tm) 可以在未纯化的去污剂溶解的膜制剂或溶解的全细胞中测定，​​揭示了不同溶解条件和稳定配体存在下的热稳定性差异。我们通过整合 split-Nluc 片段的突变（Tm 为 87 ⁰C 与 59 ⁰C）来开发热稳定性 tsNLuc，从而扩展了检测范围。ThermoBRET 可以测定 GPCR 热稳定性，这对于蛋白质纯化优化和作为药物发现筛选策略的一部分很有用。我们通过整合 split-Nluc 片段的突变（Tm 为 87 ⁰C 与 59 ⁰C）来开发热稳定性 tsNLuc，从而扩展了检测范围。ThermoBRET 可以测定 GPCR 热稳定性，这对于蛋白质纯化优化和作为药物发现筛选策略的一部分很有用。我们通过整合 split-Nluc 片段的突变（Tm 为 87 ⁰C 与 59 ⁰C）来开发热稳定性 tsNLuc，从而扩展了检测范围。ThermoBRET 可以测定 GPCR 热稳定性，这对于蛋白质纯化优化和作为药物发现筛选策略的一部分很有用。