L-theanine, a unique amino acid in green tea with health benefits, can be enzymatically synthesized by γ-glutamyltranspeptidase (γ-GT; EC 2.3.2.2). Here, a salt-tolerant γ-glutamyltranspeptidase from a marine bacterium Bacillus amyloliquefaciens was expressed in Escherichia. coli BL21 (DE3) and was shown to be optimally active at 55 °C, pH 8.5 and alkali stable. A mutant, with higher transpeptidation activity, was obtained following two rounds of directed evolution using error-prone PCR and site-saturation mutagenesis. The mutation increased the ratio of transpeptidation to hydrolysis from 1.6 to 35.6. Additionally, Kinetic analysis exhibited 17.5% decrease of Km, 13.0-fold increase of Kcat, and 16.3-fold increase of Kcat/Km in mutant V319A/S437 G versus the wild-type. The 3-D modelling analysis revealed a tighter binding pocket in mutant V319A/S437 G. The frequency of hydrogen bond between donor substrate and two residues in the catalytic pocket (Gly437 and Thr375) was enhanced, which stabilized the ligand binding and thus improved the catalytic efficiency. The optimal conditions for the biocatalytic synthesis were determined as pH 10.0, 20 μg mL-1BaGT, 200 mM L-glutamine, 2 M ethylamine, and a reaction time of 5 h. The V319A/S437 G mutant was shown to increase the percentage yield of L-theanine from 58% to 83%. These results indicate the great potential of V319A/S437 G in L-theanine production after further study.

中文翻译：

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来自解淀粉芽孢杆菌的 γ-谷氨酰转肽酶：转肽活性增强和 L-茶氨酸生产

L-茶氨酸是绿茶中一种对健康有益的独特氨基酸，可通过 γ-谷氨酰转肽酶 (γ-GT; EC 2.3.2.2) 酶促合成。在这里，来自海洋细菌解淀粉芽孢杆菌的耐盐 γ-谷氨酰转肽酶在埃希氏菌中表达。大肠杆菌 BL21 (DE3) 并被证明在 55 °C、pH 8.5 和碱稳定时具有最佳活性。在使用易错 PCR 和位点饱和诱变进行两轮定向进化后，获得了具有更高转肽活性的突变体。该突变使转肽与水解的比率从 1.6 增加到 35.6。此外，动力学分析显示突变体 V319A/S437 G 与野生型相比，Km 降低了 17.5%，Kcat 增加了 13.0 倍，Kcat/Km 增加了 16.3 倍。3-D 建模分析显示突变体 V319A/S437 G 中的结合袋更紧密。供体底物与催化袋中的两个残基（Gly437 和 Thr375）之间的氢键频率增加，稳定了配体结合，从而改善了催化效率。生物催化合成的最佳条件确定为 pH 10.0、20 μg mL-1BaGT、200 mM L-谷氨酰胺、2 M 乙胺和 5 小时的反应时间。V319A/S437 G 突变体显示出将 L-茶氨酸的百分比产量从 58% 增加到 83%。这些结果表明 V319A/S437 G 在进一步研究后在 L-茶氨酸生产中的巨大潜力。这稳定了配体结合，从而提高了催化效率。生物催化合成的最佳条件确定为 pH 10.0、20 μg mL-1BaGT、200 mM L-谷氨酰胺、2 M 乙胺和 5 小时的反应时间。V319A/S437 G 突变体显示出将 L-茶氨酸的百分比产量从 58% 增加到 83%。这些结果表明，经过进一步研究，V319A/S437 G 在 L-茶氨酸生产中具有巨大潜力。这稳定了配体结合，从而提高了催化效率。生物催化合成的最佳条件确定为 pH 10.0、20 μg mL-1BaGT、200 mM L-谷氨酰胺、2 M 乙胺和 5 小时的反应时间。V319A/S437 G 突变体显示出将 L-茶氨酸的百分比产量从 58% 增加到 83%。这些结果表明，经过进一步研究，V319A/S437 G 在 L-茶氨酸生产中具有巨大潜力。