Pseudomonas putida (P. putida) KT2440 is a paradigmatic environmental-bacterium that possesses significant potential in synthetic biology, metabolic engineering and biodegradation applications. However, most genome editing methods of P. putida KT2440 depend on heterologous repair proteins and the provision of donor DNA templates, which is laborious and inefficient. In this report, an efficient cytosine base editing system was established by using cytidine deaminase (APOBEC1), enhanced specificity Cas9 nickase (eSpCas9ppD10A) and the uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI). This constructed base editor converts C-G into T-A in the absence of DNA strands breaks and donor DNA templates. By introducing a premature stop codon in target spacers, we successfully applied this system for gene inactivation with an efficiency of 25–100% in various Pseudomonas species, including P. putida KT2440, P. aeruginosa PAO1, P. fluorescens Pf-5 and P. entomophila L48. We engineered an eSpCas9ppD10A-NG variant with a NG protospacer adjacent motif to expand base editing candidate sites. By modifying the APOBEC1 domain, we successfully narrowed the editable window to increase gene inactivation efficiency in cytidine-rich spacers. Additionally, multiplex base editing in double and triple loci was achieved with mutation efficiencies of 90–100% and 25–35%, respectively. Taken together, the establishment of a fast, convenient and universal base editing system will accelerate the pace of future research undertaken with P. putida KT2440 and other Pseudomonas species.

中文翻译：

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CRISPR 辅助的恶臭假单胞菌多重碱基编辑系统 KT2440

恶臭假单胞菌 (P. putida) KT2440 是一种典型的环境细菌，在合成生物学、代谢工程和生物降解应用中具有巨大潜力。然而，大多数恶臭假单胞菌KT2440的基因组编辑方法依赖于异源修复蛋白和供体DNA模板的提供，费力且效率低下。在本报告中，通过使用胞苷脱氨酶 (APOBEC1)、增强特异性 Cas9 切口酶 (eSpCas9ppD10A) 和尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂 (UGI) 建立了高效的胞嘧啶碱基编辑系统。这种构建的碱基编辑器在没有 DNA 链断裂和供体 DNA 模板的情况下将 CG 转化为 TA。通过在目标间隔区中引入提前终止密码子，我们成功地将该系统应用于各种假单胞菌物种的基因灭活，效率为 25-100%，包括恶臭假单胞菌 KT2440、铜绿假单胞菌 PAO1、荧光假单胞菌 Pf-5 和昆虫假单胞菌 L48。我们设计了带有 NG protospacer 相邻基序的 eSpCas9ppD10A-NG 变体，以扩展碱基编辑候选位点。通过修改 APOBEC1 域，我们成功地缩小了可编辑窗口，以提高富含胞苷间隔区的基因失活效率。此外，在双重和三重基因座中实现了多重碱基编辑，突变效率分别为 90-100% 和 25-35%。总之，建立一个快速、方便、通用的碱基编辑系统将加快未来对恶臭假单胞菌KT2440和其他假单胞菌物种的研究步伐。铜绿假单胞菌 PAO1、荧光假单胞菌 Pf-5 和昆虫假单胞菌 L48。我们设计了带有 NG protospacer 相邻基序的 eSpCas9ppD10A-NG 变体，以扩展碱基编辑候选位点。通过修改 APOBEC1 域，我们成功地缩小了可编辑窗口，以提高富含胞苷间隔区的基因失活效率。此外，在双重和三重基因座中实现了多重碱基编辑，突变效率分别为 90-100% 和 25-35%。总之，建立一个快速、方便、通用的碱基编辑系统将加快未来对恶臭假单胞菌KT2440和其他假单胞菌物种的研究步伐。铜绿假单胞菌 PAO1、荧光假单胞菌 Pf-5 和昆虫假单胞菌 L48。我们设计了带有 NG protospacer 相邻基序的 eSpCas9ppD10A-NG 变体，以扩展碱基编辑候选位点。通过修改 APOBEC1 域，我们成功地缩小了可编辑窗口，以提高富含胞苷间隔区的基因失活效率。此外，在双重和三重基因座中实现了多重碱基编辑，突变效率分别为 90-100% 和 25-35%。总之，建立一个快速、方便、通用的碱基编辑系统将加快未来对恶臭假单胞菌KT2440和其他假单胞菌物种的研究步伐。通过修改 APOBEC1 域，我们成功地缩小了可编辑窗口，以提高富含胞苷间隔区的基因失活效率。此外，在双重和三重基因座中实现了多重碱基编辑，突变效率分别为 90-100% 和 25-35%。总之，建立一个快速、方便、通用的碱基编辑系统将加快未来对恶臭假单胞菌KT2440和其他假单胞菌物种的研究步伐。通过修改 APOBEC1 域，我们成功地缩小了可编辑窗口，以提高富含胞苷间隔区的基因失活效率。此外，在双重和三重基因座中实现了多重碱基编辑，突变效率分别为 90-100% 和 25-35%。总之，建立一个快速、方便、通用的碱基编辑系统将加快未来对恶臭假单胞菌KT2440和其他假单胞菌物种的研究步伐。