The siderophore biosynthetic enzyme A (SidA) ornithine hydroxylase from Aspergillus fumigatus is a fungal disease drug target involved in the production of hydroxamate-containing siderophores, which are used by the pathogen to sequester iron. SidA is an N-monooxygenase that catalyzes the NADPH-dependent hydroxylation of l-ornithine through a multistep oxidative mechanism, utilizing a C4a-hydroperoxyflavin intermediate. Here we present four new crystal structures of SidA in various redox and ligation states, including the first structure of oxidized SidA without NADP(H) or l-ornithine bound (resting state). The resting state structure reveals a new out active site conformation characterized by large rotations of the FAD isoalloxazine around the C1–′C2′ and N10–C1′ bonds, coupled to a 10-Å movement of the Tyr-loop. Additional structures show that either flavin reduction or the binding of NADP(H) is sufficient to drive the FAD to the in conformation. The structures also reveal protein conformational changes associated with the binding of NADP(H) and l-ornithine. Some of these residues were probed using site-directed mutagenesis. Docking was used to explore the active site of the out conformation. These calculations identified two potential ligand-binding sites. Altogether, our results provide new information about conformational dynamics in flavin-dependent monooxygenases. Understanding the different active site conformations that appear during the catalytic cycle may allow fine-tuning of inhibitor discovery efforts.

中文翻译：

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在晶体中捕获黄素依赖性 N-单加氧酶的构象状态揭示蛋白质和黄素动力学。

来自烟曲霉的铁载体生物合成酶 A (SidA) 鸟氨酸羟化酶是一种真菌疾病药物靶点，参与产生含异羟肟酸的铁载体，病原体使用这些铁载体来螯合铁。SidA 是一种 N-单加氧酶，利用 C4a-氢过氧黄素中间体，通过多步氧化机制催化 L-鸟氨酸的 NADPH 依赖性羟基化。在这里，我们展示了处于各种氧化还原和连接状态的 SidA 的四种新晶体结构，包括没有 NADP(H) 或 l-鸟氨酸结合（静止状态）的氧化 SidA 的第一个结构。静息状态结构揭示了一种新的活性位点构象，其特征是 FAD 异恶嗪围绕 C1-'C2' 和 N10-C1' 键的大旋转，与 Tyr 环的 10 Å 运动耦合。其他结构表明黄素减少或 NADP(H) 的结合足以驱动 FAD 进入构象。这些结构还揭示了与 NADP(H) 和 l-鸟氨酸结合相关的蛋白质构象变化。使用定点诱变探测这些残基中的一些。对接用于探索外构象的活性位点。这些计算确定了两个潜在的配体结合位点。总之，我们的结果提供了有关黄素依赖性单加氧酶构象动力学的新信息。了解催化循环中出现的不同活性位点构象可能有助于微调抑制剂的发现工作。这些结构还揭示了与 NADP(H) 和 l-鸟氨酸结合相关的蛋白质构象变化。使用定点诱变探测这些残基中的一些。对接用于探索外构象的活性位点。这些计算确定了两个潜在的配体结合位点。总之，我们的结果提供了有关黄素依赖性单加氧酶构象动力学的新信息。了解催化循环中出现的不同活性位点构象可能有助于微调抑制剂的发现工作。这些结构还揭示了与 NADP(H) 和 l-鸟氨酸结合相关的蛋白质构象变化。使用定点诱变探测这些残基中的一些。对接用于探索外构象的活性位点。这些计算确定了两个潜在的配体结合位点。总之，我们的结果提供了有关黄素依赖性单加氧酶构象动力学的新信息。了解催化循环中出现的不同活性位点构象可能有助于微调抑制剂的发现工作。总之，我们的结果提供了有关黄素依赖性单加氧酶构象动力学的新信息。了解催化循环中出现的不同活性位点构象可能有助于微调抑制剂的发现工作。总之，我们的结果提供了有关黄素依赖性单加氧酶构象动力学的新信息。了解催化循环中出现的不同活性位点构象可能有助于微调抑制剂的发现工作。