ABSTRACT

Extracellular vesicles (EVs) have been implicated in a wide variety of biological activities, have been implicated in the pathogenesis of numerous diseases, and have been proposed to serve as potential biomarkers of disease in human patients and animal models. However, characterization of EV populations is often performed using methods that do not account for the heterogeneity of EV populations and require comparatively large sample sizes to facilitate analysis. Here, we describe an imaging-based method that allows for the multiplexed characterization of EV populations at the single EV level following centrifugation of EV populations directly onto cover slips, allowing comprehensive analysis of EV populations with relatively small samples. We observe that canonical EV markers are present on subsets of EVs which differ substantially in a producer cell and cargo specific fashion, including differences in EVs containing different HIV-1 proteins previously reported to be incorporated into pathogenic EVs. We also describe a lectin binding assay to interrogate EVs based on their glycan content, which we observe to change in response to pharmacological modulation of secretory autophagy pathways. These studies collectively reveal that a multiplexed analysis of EV populations using fluorescent microscopy can reveal differences in specific EV populations that may be used to understand the biogenesis of specific EV populations and/or to interrogate small subsets of EVs of interest within larger EV populations in biological samples.

摘要

细胞外囊泡（EVs）已涉及多种生物学活动，已涉及多种疾病的发病机理，并已提出可作为人类患者和动物模型中疾病的潜在生物标记。但是，通常使用不考虑EV人群异质性且需要相对较大的样本量以方便分析的方法来进行EV人群的表征。在这里，我们描述了一种基于成像的方法，该方法允许将EV人口直接离心到盖玻片上后，在单个EV水平上对EV人口进行多重表征，从而可以使用较小的样本对EV人口进行全面分析。我们观察到，典型的EV标记存在于EV的子集上，这些子集在生产者细胞和货物特定的方式上有很大不同，包括先前报道被掺入病原性EV的含有不同HIV-1蛋白的EV的差异。我们还描述了一种凝集素结合测定法，基于它们的聚糖含量来审问EV，我们观察到其响应分泌自噬途径的药理学调节而发生变化。这些研究共同表明，使用荧光显微镜对电动汽车人群进行多重分析可以揭示特定电动汽车人群的差异，这些差异可用于了解特定电动汽车人群的生物发生和/或在生物学中较大电动汽车人群中询问感兴趣的电动汽车的小子集。样品。包括先前报道已掺入病原性电动汽车中的含有不同HIV-1蛋白的电动汽车中的差异。我们还描述了一种凝集素结合测定法，基于它们的聚糖含量来审问EV，我们观察到其响应分泌自噬途径的药理学调节而发生变化。这些研究共同表明，使用荧光显微镜对电动汽车人群进行多重分析可以揭示特定电动汽车人群的差异，这些差异可用于了解特定电动汽车人群的生物发生和/或在生物学中较大电动汽车人群中询问感兴趣的电动汽车的小子集。样品。包括先前报道已掺入病原性电动汽车中的含有不同HIV-1蛋白的电动汽车中的差异。我们还描述了一种凝集素结合测定法，基于它们的聚糖含量来审问EV，我们观察到其响应分泌自噬途径的药理学调节而发生变化。这些研究共同表明，使用荧光显微镜对电动汽车人群进行多重分析可以揭示特定电动汽车人群的差异，这些差异可用于了解特定电动汽车人群的生物发生和/或在生物学中较大电动汽车人群中询问感兴趣的电动汽车的小子集。样品。我们观察到它对分泌自噬途径的药理调节有反应。这些研究共同表明，使用荧光显微镜对电动汽车人群进行多重分析可以揭示特定电动汽车人群的差异，这些差异可用于了解特定电动汽车人群的生物发生和/或在生物学中较大电动汽车人群中询问感兴趣的电动汽车的小子集。样品。我们观察到它对分泌自噬途径的药理调节有反应。这些研究共同表明，使用荧光显微镜对电动汽车人群进行多重分析可以揭示特定电动汽车人群的差异，这些差异可用于了解特定电动汽车人群的生物发生和/或在生物学中较大电动汽车人群中询问感兴趣的电动汽车的小子集。样品。