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Terminal Uridylyl Transferase Mediated Site-Directed Access to Clickable Chromatin Employing CRISPR-dCas9
Journal of the American Chemical Society ( IF 14.4 ) Pub Date : 2020-07-13 , DOI: 10.1021/jacs.0c06541 Jerrin Thomas George 1 , Mohd Azhar , Meghali Aich , Dipanjali Sinha , Uddhav B Ambi 1 , Souvik Maiti 2 , Debojyoti Chakraborty , Seergazhi G Srivatsan 1
Journal of the American Chemical Society ( IF 14.4 ) Pub Date : 2020-07-13 , DOI: 10.1021/jacs.0c06541 Jerrin Thomas George 1 , Mohd Azhar , Meghali Aich , Dipanjali Sinha , Uddhav B Ambi 1 , Souvik Maiti 2 , Debojyoti Chakraborty , Seergazhi G Srivatsan 1
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Locus-specific interrogation of target genes employing functional probes such as proteins and small molecules is paramount in decoding the molecular basis of gene function and designing tools to modulate its downstream effects. In this context, CRISPR-based gene editing and targeting technologies have proved tremendously useful as they can be programmed to target any gene of interest by simply changing the sequence of the single guide RNA (sgRNA). Although these technologies are widely utilized in recruiting genetically encoded functional proteins, display of small molecules using CRISPR system is not well developed due to the lack of adequate techniques. Here, we have devised an innovative technology called sgRNA-Click (sgR-CLK) that harnesses the power of bioorthogonal click chemistry for remodeling guide RNA to display synthetic molecules on target genes. sgR-CLK employs a novel posttranscriptional chemo-enzymatic labeling platform wherein a terminal uridylyl transferase (TUTase) was repurposed to generate clickable sgRNA of choice by site-specific tailoring of multiple azide-modified nucleotide analogs at the 3' end. The presence of a minimally invasive azide handle assured that the sgRNAs are indeed functional. Notably, an azide-tailed sgRNA targeting the telomeric repeat served as a Trojan horse on CRISPR-dCas9 system to guide synthetic tags (biotin) site-specifically on chromatin employing copper-catalyzed or strain-promoted click reactions. Taken together, sgR-CLK presents a significant advancement on the utility of bioorthogonal chemistry, TUTase and CRISPR toolbox, which could offer a simplified solution for site-directed display of small molecule probes and diagnostic tools on target genes.
中文翻译：
使用 CRISPR-dCas9 末端尿苷酰转移酶介导的可点击染色质定点访问
使用蛋白质和小分子等功能探针对靶基因进行位点特异性询问对于解码基因功能的分子基础和设计调节其下游效应的工具至关重要。在这种情况下，基于 CRISPR 的基因编辑和靶向技术已被证明非常有用，因为它们可以通过简单地改变单引导 RNA (sgRNA) 的序列来编程以靶向任何感兴趣的基因。尽管这些技术被广泛应用于招募基因编码的功能蛋白，但由于缺乏足够的技术，使用 CRISPR 系统展示小分子的技术尚未得到很好的发展。在这里，我们设计了一种名为 sgRNA-Click (sgR-CLK) 的创新技术，该技术利用生物正交点击化学的力量来重塑向导 RNA，以在目标基因上显示合成分子。 sgR-CLK 采用新型转录后化学酶标记平台，其中末端尿苷酰转移酶 (TUTase) 被重新调整用途，通过在 3' 端对多个叠氮化物修饰的核苷酸类似物进行位点特异性剪裁来生成选择的可点击 sgRNA。微创叠氮化物手柄的存在确保了 sgRNA 确实具有功能。值得注意的是，靶向端粒重复序列的叠氮尾 sgRNA 在 CRISPR-dCas9 系统上充当特洛伊木马，利用铜催化或菌株促进的点击反应，在染色质上位点特异性引导合成标签（生物素）。总而言之，sgR-CLK 在生物正交化学、TUTase 和 CRISPR 工具箱的实用性方面取得了重大进展，可以为目标基因上小分子探针和诊断工具的定点显示提供简化的解决方案。
更新日期：2020-07-13
中文翻译：
使用 CRISPR-dCas9 末端尿苷酰转移酶介导的可点击染色质定点访问
使用蛋白质和小分子等功能探针对靶基因进行位点特异性询问对于解码基因功能的分子基础和设计调节其下游效应的工具至关重要。在这种情况下，基于 CRISPR 的基因编辑和靶向技术已被证明非常有用，因为它们可以通过简单地改变单引导 RNA (sgRNA) 的序列来编程以靶向任何感兴趣的基因。尽管这些技术被广泛应用于招募基因编码的功能蛋白，但由于缺乏足够的技术，使用 CRISPR 系统展示小分子的技术尚未得到很好的发展。在这里，我们设计了一种名为 sgRNA-Click (sgR-CLK) 的创新技术，该技术利用生物正交点击化学的力量来重塑向导 RNA，以在目标基因上显示合成分子。 sgR-CLK 采用新型转录后化学酶标记平台，其中末端尿苷酰转移酶 (TUTase) 被重新调整用途，通过在 3' 端对多个叠氮化物修饰的核苷酸类似物进行位点特异性剪裁来生成选择的可点击 sgRNA。微创叠氮化物手柄的存在确保了 sgRNA 确实具有功能。值得注意的是，靶向端粒重复序列的叠氮尾 sgRNA 在 CRISPR-dCas9 系统上充当特洛伊木马，利用铜催化或菌株促进的点击反应，在染色质上位点特异性引导合成标签（生物素）。总而言之，sgR-CLK 在生物正交化学、TUTase 和 CRISPR 工具箱的实用性方面取得了重大进展，可以为目标基因上小分子探针和诊断工具的定点显示提供简化的解决方案。
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