ABSTRACT Anionic phospholipid phosphatidic acid (PA) behaves as an important second messenger involved in many cellular processes, such as development, cytoskeletal dynamics, vesicle trafficking, and stress response. Recently, it was reported that PA can directly bind with the rice Shaker K+ channel OsAKT2 to inhibit its channel activity. Two adjacent arginine residues (R644 and R645) in ANK domain were identified as a PA-binding site essential to the PA-mediated inhibition of OsAKT2. However, there may be still other PA-binding sites unidentified in OsAKT2. Here, using a PA biosensor (PAleon), we found that the exogenous PA treatment significantly increased the PA level at the plasma membrane of Xenopus oocytes which were used to express OsAKT2 for electrophysiological assays. As reported previously, exogenous PA markedly inhibited OsAKT2 K+ currents. Replacement of two adjacent basic residues (R190 and K191) in the S4 voltage sensor by glycine completely abolished the time-dependent K+ currents of OsAKT2, but this variant was insensitive to PA treatment. In addition, we also identified other two adjacent arginines (R755 and R756) located in the cytosolic domain as a PA-binding site, which were also essential to the PA-mediated inhibition of OsAKT2. These results provide a more comprehensive understanding of the PA-K+ channel interaction mechanism. Combining the findings here with the previous study, we propose that multiple basic residues (R190/K191, R644/R645, and R755/R756) in different domains of OsAKT2 contribute to PA-mediated regulation of OsAKT2.

中文翻译：

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多个碱性氨基酸残基有助于磷脂酸介导的水稻钾通道 OsAKT2 抑制

摘要阴离子磷脂磷脂酸 (PA) 是重要的第二信使，参与许多细胞过程，如发育、细胞骨架动力学、囊泡运输和应激反应。最近有报道称PA可以直接与水稻Shaker K+通道OsAKT2结合，抑制其通道活性。ANK 域中的两个相邻精氨酸残基（R644 和 R645）被鉴定为 PA 结合位点，对 PA 介导的 OsAKT2 抑制至关重要。然而，在 OsAKT2 中可能还有其他未识别的 PA 结合位点。在这里，使用 PA 生物传感器 (PAleon)，我们发现外源 PA 处理显着增加了非洲爪蟾卵母细胞质膜上的 PA 水平，用于表达 OsAKT2 以进行电生理测定。正如之前报道的那样，外源性 PA 显着抑制 OsAKT2 K+ 电流。用甘氨酸替换 S4 电压传感器中两个相邻的碱性残基（R190 和 K191）完全消除了 OsAKT2 的时间依赖性 K+ 电流，但该变体对 PA 处理不敏感。此外，我们还确定了位于胞质结构域中的另外两个相邻的精氨酸（R755 和 R756）作为 PA 结合位点，这对于 PA 介导的 OsAKT2 抑制也是必不可少的。这些结果提供了对 PA-K+ 通道相互作用机制的更全面的理解。将这里的发现与之前的研究相结合，我们提出 OsAKT2 不同结构域中的多个基本残基（R190/K191、R644/R645 和 R755/R756）有助于 PA 介导的 OsAKT2 调节。用甘氨酸替换 S4 电压传感器中两个相邻的碱性残基（R190 和 K191）完全消除了 OsAKT2 的时间依赖性 K+ 电流，但该变体对 PA 处理不敏感。此外，我们还确定了位于胞质结构域中的另外两个相邻的精氨酸（R755 和 R756）作为 PA 结合位点，这对于 PA 介导的 OsAKT2 抑制也是必不可少的。这些结果提供了对 PA-K+ 通道相互作用机制的更全面的理解。将这里的发现与之前的研究相结合，我们提出 OsAKT2 不同结构域中的多个基本残基（R190/K191、R644/R645 和 R755/R756）有助于 PA 介导的 OsAKT2 调节。用甘氨酸替换 S4 电压传感器中两个相邻的碱性残基（R190 和 K191）完全消除了 OsAKT2 的时间依赖性 K+ 电流，但该变体对 PA 处理不敏感。此外，我们还确定了位于胞质结构域中的另外两个相邻的精氨酸（R755 和 R756）作为 PA 结合位点，这对于 PA 介导的 OsAKT2 抑制也是必不可少的。这些结果提供了对 PA-K+ 通道相互作用机制的更全面的理解。将这里的发现与之前的研究相结合，我们提出 OsAKT2 不同结构域中的多个基本残基（R190/K191、R644/R645 和 R755/R756）有助于 PA 介导的 OsAKT2 调节。我们还确定了位于胞质结构域中的另外两个相邻的精氨酸（R755 和 R756）作为 PA 结合位点，这对于 PA 介导的 OsAKT2 抑制也是必不可少的。这些结果提供了对 PA-K+ 通道相互作用机制的更全面的理解。将这里的发现与之前的研究相结合，我们提出 OsAKT2 不同结构域中的多个基本残基（R190/K191、R644/R645 和 R755/R756）有助于 PA 介导的 OsAKT2 调节。我们还确定了位于胞质结构域中的另外两个相邻的精氨酸（R755 和 R756）作为 PA 结合位点，这对于 PA 介导的 OsAKT2 抑制也是必不可少的。这些结果提供了对 PA-K+ 通道相互作用机制的更全面的理解。将这里的发现与之前的研究相结合，我们提出 OsAKT2 不同结构域中的多个基本残基（R190/K191、R644/R645 和 R755/R756）有助于 PA 介导的 OsAKT2 调节。