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Interrogating surface versus intracellular transmembrane receptor populations using cell-impermeable SNAP-tag substrates
Chemical Science ( IF 7.6 ) Pub Date : 2020-07-07 , DOI: 10.1039/d0sc02794d Pascal Poc 1 , Vanessa A Gutzeit 2 , Julia Ast 3, 4 , Joon Lee 5 , Ben J Jones 6 , Elisa D'Este 7 , Bettina Mathes 1 , Martin Lehmann 8 , David J Hodson 3, 4 , Joshua Levitz 5, 9 , Johannes Broichhagen 1, 10
Chemical Science ( IF 7.6 ) Pub Date : 2020-07-07 , DOI: 10.1039/d0sc02794d Pascal Poc 1 , Vanessa A Gutzeit 2 , Julia Ast 3, 4 , Joon Lee 5 , Ben J Jones 6 , Elisa D'Este 7 , Bettina Mathes 1 , Martin Lehmann 8 , David J Hodson 3, 4 , Joshua Levitz 5, 9 , Johannes Broichhagen 1, 10
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Employing self-labelling protein tags for the attachment of fluorescent dyes has become a routine and powerful technique in optical microscopy to visualize and track fused proteins. However, membrane permeability of the dyes and the associated background signals can interfere with the analysis of extracellular labelling sites. Here we describe a novel approach to improve extracellular labelling by functionalizing the SNAP-tag substrate benzyl guanine (“BG”) with a charged sulfonate (“SBG”). This chemical manipulation can be applied to any SNAP-tag substrate, improves solubility, reduces non-specific staining and renders the bioconjugation handle impermeable while leaving its cargo untouched. We report SBG-conjugated fluorophores across the visible spectrum, which cleanly label SNAP-fused proteins in the plasma membrane of living cells. We demonstrate the utility of SBG-conjugated fluorophores to interrogate class A, B and C G protein-coupled receptors (GPCRs) using a range of imaging approaches including nanoscopic superresolution imaging, analysis of GPCR trafficking from intra- and extracellular pools, in vivo labelling in mouse brain and analysis of receptor stoichiometry using single molecule pull down.
中文翻译：
使用细胞不可渗透的 SNAP 标签基质研究表面与细胞内跨膜受体群体
采用自标记蛋白标签来附着荧光染料已成为光学显微镜中可视化和跟踪融合蛋白的常规且强大的技术。然而，染料的膜渗透性和相关的背景信号可能会干扰细胞外标记位点的分析。在这里，我们描述了一种通过用带电磺酸盐（“SBG”）功能化 SNAP 标签底物苄基鸟嘌呤（“BG”）来改善细胞外标记的新方法。这种化学操作可应用于任何 SNAP 标签底物，提高溶解度，减少非特异性染色，并使生物共轭手柄不渗透，同时保持其货物不受影响。我们报告了整个可见光谱的 SBG 共轭荧光团，它可以清楚地标记活细胞质膜中的 SNAP 融合蛋白。我们展示了 SBG 缀合荧光团在询问 A 类、B 类和 CG 蛋白偶联受体 (GPCR) 方面的实用性，使用一系列成像方法，包括纳米级超分辨率成像、细胞内和细胞外池中 GPCR 运输的分析、体内标记小鼠大脑和使用单分子下拉进行受体化学计量分析。
更新日期：2020-08-05
中文翻译：
使用细胞不可渗透的 SNAP 标签基质研究表面与细胞内跨膜受体群体
采用自标记蛋白标签来附着荧光染料已成为光学显微镜中可视化和跟踪融合蛋白的常规且强大的技术。然而，染料的膜渗透性和相关的背景信号可能会干扰细胞外标记位点的分析。在这里，我们描述了一种通过用带电磺酸盐（“SBG”）功能化 SNAP 标签底物苄基鸟嘌呤（“BG”）来改善细胞外标记的新方法。这种化学操作可应用于任何 SNAP 标签底物，提高溶解度，减少非特异性染色，并使生物共轭手柄不渗透，同时保持其货物不受影响。我们报告了整个可见光谱的 SBG 共轭荧光团，它可以清楚地标记活细胞质膜中的 SNAP 融合蛋白。我们展示了 SBG 缀合荧光团在询问 A 类、B 类和 CG 蛋白偶联受体 (GPCR) 方面的实用性，使用一系列成像方法，包括纳米级超分辨率成像、细胞内和细胞外池中 GPCR 运输的分析、体内标记小鼠大脑和使用单分子下拉进行受体化学计量分析。
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