Specific genomic functions are dictated by macromolecular complexes (MCs) containing multiple proteins. Affinity purification of these complexes, often using antibodies, followed by mass spectrometry (MS) has revolutionized our ability to identify the composition of MCs. However, conventional immunoprecipitations suffer from contaminating antibody/serum-derived peptides that limit the sensitivity of detection for low-abundant interacting partners using MS. Here, we present AptA–MS (aptamer affinity–mass spectrometry), a robust strategy primarily using a specific, high-affinity RNA aptamer against Green Fluorescent Protein (GFP) to identify interactors of a GFP-tagged protein of interest by high-resolution MS. Utilizing this approach, we have identified the known molecular chaperones that interact with human Heat Shock Factor 1 (HSF1), and observed an increased association with several proteins upon heat shock, including translation elongation factors and histones. HSF1 is known to be regulated by multiple post-translational modifications (PTMs), and we observe both known and new sites of modifications on HSF1. We show that AptA–MS provides a dramatic target enrichment and detection sensitivity in evolutionarily diverse organisms and allows identification of PTMs without the need for modification-specific enrichments. In combination with the expanding libraries of GFP-tagged cell lines, this strategy offers a general, inexpensive, and high-resolution alternative to conventional approaches for studying MCs.

中文翻译：

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用于质谱分析的大分子复合物的 RNA 适体捕获。

特定的基因组功能由包含多种蛋白质的大分子复合物 (MC) 决定。这些复合物的亲和纯化，通常使用抗体，然后进行质谱 (MS)，彻底改变了我们识别 MC 组成的能力。然而，传统的免疫沉淀受到抗体/血清衍生肽的污染，限制了使用 MS 检测低丰度相互作用伙伴的灵敏度。在这里，我们提出了 AptA–MS（适体亲和力-质谱法），这是一种稳健的策略，主要使用针对绿色荧光蛋白 (GFP) 的特定高亲和力 RNA 适体，通过高分辨率识别 GFP 标记的目标蛋白的相互作用体多发性硬化症。利用这种方法，我们已经确定了与人类热休克因子 1 (HSF1) 相互作用的已知分子伴侣，并观察到热休克后与几种蛋白质的关联增加，包括翻译延伸因子和组蛋白。已知 HSF1 受多个翻译后修饰 (PTM) 的调节，我们观察到 HSF1 上已知和新的修饰位点。我们表明，AptA–MS 在进化多样的生物体中提供了显着的靶标富集和检测灵敏度，并且无需进行特定修饰的富集即可识别 PTM。结合不断扩展的 GFP 标记细胞系文库，该策略提供了一种通用、廉价且高分辨率的替代方法，可替代用于研究 MC 的传统方法。已知 HSF1 受多个翻译后修饰 (PTM) 的调节，我们观察到 HSF1 上已知和新的修饰位点。我们表明，AptA–MS 在进化多样的生物体中提供了显着的靶标富集和检测灵敏度，并且无需进行特定修饰的富集即可识别 PTM。结合不断扩展的 GFP 标记细胞系文库，该策略提供了一种通用、廉价且高分辨率的替代方法，可替代用于研究 MC 的传统方法。已知 HSF1 受多个翻译后修饰 (PTM) 的调节，我们观察到 HSF1 上已知和新的修饰位点。我们表明，AptA–MS 在进化多样的生物体中提供了显着的靶标富集和检测灵敏度，并且无需进行特定修饰的富集即可识别 PTM。结合不断扩展的 GFP 标记细胞系文库，该策略提供了一种通用、廉价且高分辨率的替代方法，可替代用于研究 MC 的传统方法。