Cryo‐electron tomography (cryo‐ET) is a groundbreaking technology for 3D visualisation and analysis of biomolecules in the context of cellular structures. It allows structural investigations of single proteins as well as their spatial arrangements within the cell. Cryo‐tomograms provide a snapshot of the complex, heterogeneous and transient subcellular environment. Due to the excellent structure preservation in amorphous ice, it is possible to study interactions and spatial relationships of proteins in their native state without interference caused by chemical fixatives or contrasting agents. With the introduction of focused ion beam (FIB) technology, the preparation of cellular samples for electron tomography has become much easier and faster. The latest generation of integrated FIB and scanning electron microscopy (SEM) instruments (dual beam microscopes), specifically designed for cryo‐applications, provides advances in automation, imaging and the preparation of high‐pressure frozen bulk samples using cryo‐lift‐out technology. In addition, correlative cryo‐fluorescence microscopy provides cellular targeting information through integrated software and hardware interfaces. The rapid advances, based on the combination of correlative cryo‐microscopy, cryo‐FIB and cryo‐ET, have already led to a wealth of new insights into cellular processes and provided new 3D image data of the cell. Here we introduce our recent developments within the cryo‐tomography workflow, and we discuss the challenges that lie ahead.

中文翻译：

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先进的冷冻断层扫描工作流程开发——相关显微镜、铣削自动化和冷冻提取

冷冻电子断层扫描 (cryo-ET) 是一项突破性技术，用于在细胞结构的背景下对生物分子进行 3D 可视化和分析。它允许对单个蛋白质及其在细胞内的空间排列进行结构研究。冷冻断层照片提供了复杂、异质和瞬态亚细胞环境的快照。由于在无定形冰中具有出色的结构保存能力，因此可以研究天然状态下蛋白质的相互作用和空间关系，而不会受到化学固定剂或造影剂的干扰。随着聚焦离子束 (FIB) 技术的引入，用于电子断层扫描的细胞样本的制备变得更加容易和快捷。专为低温应用而设计的最新一代集成 FIB 和扫描电子显微镜 (SEM) 仪器（双光束显微镜）在自动化、成像和使用低温提取技术制备高压冷冻散装样品方面取得了进步. 此外，相关低温荧光显微镜通过集成的软件和硬件接口提供细胞靶向信息。基于相关低温显微镜、cryo-FIB 和 cryo-ET 的组合的快速发展已经为细胞过程带来了丰富的新见解，并提供了新的细胞 3D 图像数据。在这里，我们介绍了我们在冷冻断层扫描工作流程中的最新进展，并讨论了未来的挑战。提供了自动化、成像和使用冷冻提取技术制备高压冷冻散装样品的进步。此外，相关低温荧光显微镜通过集成的软件和硬件接口提供细胞靶向信息。基于相关低温显微镜、cryo-FIB 和 cryo-ET 的组合的快速发展已经为细胞过程带来了丰富的新见解，并提供了新的细胞 3D 图像数据。在这里，我们介绍了我们在冷冻断层扫描工作流程中的最新进展，并讨论了未来的挑战。提供了自动化、成像和使用冷冻提取技术制备高压冷冻散装样品的进步。此外，相关低温荧光显微镜通过集成的软件和硬件接口提供细胞靶向信息。基于相关低温显微镜、cryo-FIB 和 cryo-ET 的组合的快速发展已经为细胞过程带来了丰富的新见解，并提供了新的细胞 3D 图像数据。在这里，我们介绍了我们在冷冻断层扫描工作流程中的最新进展，并讨论了未来的挑战。相关低温荧光显微镜通过集成的软件和硬件接口提供细胞靶向信息。基于相关低温显微镜、cryo-FIB 和 cryo-ET 的组合的快速发展已经为细胞过程带来了丰富的新见解，并提供了新的细胞 3D 图像数据。在这里，我们介绍了我们在冷冻断层扫描工作流程中的最新进展，并讨论了未来的挑战。相关低温荧光显微镜通过集成的软件和硬件接口提供细胞靶向信息。基于相关低温显微镜、cryo-FIB 和 cryo-ET 的组合的快速发展已经为细胞过程带来了丰富的新见解，并提供了新的细胞 3D 图像数据。在这里，我们介绍了我们在冷冻断层扫描工作流程中的最新进展，并讨论了未来的挑战。