RNF43 and its homolog ZNRF3 are transmembrane E3 ubiquitin ligases frequently mutated in many human cancer types. Their main role relays on the inhibition of canonical Wnt signaling by the negative regulation of frizzled receptors and LRP5/6 co-receptors levels at the plasma membrane. Intracellular RING domains of RNF43/ZNRF3 mediate the key enzymatic activity of these proteins, but the function of the extracellular Protease Associated (PA) fold in the inhibition of Wnt/β-catenin pathway is controversial up-to date, apart from the interaction with secreted antagonists R-spondin family proteins shown by the crystallographic studies. In our research we utilised cell-based approaches to study the role of RNF43 lacking PA domain in the canonical Wnt signalling pathway transduction. We developed controlled overexpression (TetON) and CRISPR/Cas9 mediated knock-out models in human cells. RNF43ΔPA mutant activity impedes canonical Wnt pathway, as manifested by the reduced phosphorylation of LRP6, DVL2 and DVL3 and by the decreased β-catenin-dependent gene expression. Finally, rescue experiments in the CRISPR/Cas9 derived RNF43/ZNRF3 double knock-out cell lines showed that RNFΔPA overexpression is enough to inhibit activation of LRP6 and β-catenin activity as shown by the Western blot and Top flash dual luciferase assays. Moreover, RNF43 variant without PA domain was not sensitive to the R-spondin1 treatment. Taken together, our results help to understand better the mode of RNF43 tumor suppressor action and solve some discrepancies present in the field.

中文翻译：

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RNF43 的蛋白酶相关结构域对于抑制人类细胞中的 Wnt/β-连环蛋白信号传导不是必需的。

RNF43 及其同源物 ZNRF3 是跨膜 E3 泛素连接酶，在许多人类癌症类型中经常发生突变。它们的主要作用是通过对质膜上卷曲受体和 LRP5/6 共受体水平的负调节来抑制经典 Wnt 信号。RNF43/ZNRF3 的细胞内 RING 结构域介导了这些蛋白质的关键酶活性，但除了与晶体学研究显示分泌的拮抗剂 R-spondin 家族蛋白。在我们的研究中，我们利用基于细胞的方法来研究缺乏 PA 结构域的 RNF43 在经典 Wnt 信号通路转导中的作用。我们在人类细胞中开发了受控过表达 (TetON) 和 CRISPR/Cas9 介导的敲除模型。RNF43ΔPA 突变体活性阻碍了经典 Wnt 通路，表现为 LRP6、DVL2 和 DVL3 的磷酸化降低以及 β-连环蛋白依赖性基因表达降低。最后，在 CRISPR/Cas9 衍生的 RNF43/ZNRF3 双敲除细胞系中进行的拯救实验表明，如蛋白质印迹和 Top flash 双荧光素酶测定所示，RNFΔPA 过表达足以抑制 LRP6 的激活和 β-连环蛋白活性。此外，没有 PA 结构域的 RNF43 变体对 R-spondin1 处理不敏感。总之，我们的结果有助于更好地了解 RNF43 肿瘤抑制作用的模式并解决该领域存在的一些差异。RNF43ΔPA 突变体活性阻碍了经典 Wnt 通路，表现为 LRP6、DVL2 和 DVL3 的磷酸化降低以及 β-连环蛋白依赖性基因表达降低。最后，在 CRISPR/Cas9 衍生的 RNF43/ZNRF3 双敲除细胞系中的拯救实验表明，如蛋白质印迹和 Top flash 双荧光素酶测定所示，RNFΔPA 过表达足以抑制 LRP6 的激活和 β-连环蛋白活性。此外，没有 PA 结构域的 RNF43 变体对 R-spondin1 处理不敏感。总之，我们的结果有助于更好地了解 RNF43 肿瘤抑制作用的模式并解决该领域存在的一些差异。RNF43ΔPA 突变体活性阻碍了经典 Wnt 通路，表现为 LRP6、DVL2 和 DVL3 的磷酸化降低以及 β-连环蛋白依赖性基因表达降低。最后，在 CRISPR/Cas9 衍生的 RNF43/ZNRF3 双敲除细胞系中的拯救实验表明，如蛋白质印迹和 Top flash 双荧光素酶测定所示，RNFΔPA 过表达足以抑制 LRP6 的激活和 β-连环蛋白活性。此外，没有 PA 结构域的 RNF43 变体对 R-spondin1 处理不敏感。总之，我们的结果有助于更好地了解 RNF43 肿瘤抑制作用的模式并解决该领域存在的一些差异。在 CRISPR/Cas9 衍生的 RNF43/ZNRF3 双敲除细胞系中进行的救援实验表明，如蛋白质印迹和 Top flash 双荧光素酶测定所示，RNFΔPA 过表达足以抑制 LRP6 的激活和 β-连环蛋白活性。此外，没有 PA 结构域的 RNF43 变体对 R-spondin1 处理不敏感。总之，我们的结果有助于更好地了解 RNF43 肿瘤抑制作用的模式并解决该领域存在的一些差异。在 CRISPR/Cas9 衍生的 RNF43/ZNRF3 双敲除细胞系中进行的救援实验表明，如蛋白质印迹和 Top flash 双荧光素酶测定所示，RNFΔPA 过表达足以抑制 LRP6 的激活和 β-连环蛋白活性。此外，没有 PA 结构域的 RNF43 变体对 R-spondin1 处理不敏感。总之，我们的结果有助于更好地了解 RNF43 肿瘤抑制作用的模式并解决该领域存在的一些差异。