Many methods exist to detect RNA modifications by short-read sequencing, relying on either antibody enrichment of transcripts bearing modified bases or mutational profiling approaches which require conversion to cDNA. Endogenous modifications are present on several major classes of RNA including tRNA, rRNA and mRNA and can modulate diverse biological processes such as genetic recoding, mRNA export and RNA folding. In addition, exogenous modifications can be introduced to RNA molecules to reveal RNA structure and dynamics. Limitations on read length and library size inherent in short-read-based methods dissociate modifications from their native context, preventing single molecule analysis and modification phasing. Here we demonstrate direct RNA nanopore sequencing to detect endogenous and exogenous RNA modifications over long sequence distance at the single molecule level. We demonstrate comprehensive detection of endogenous modifications in E. coli and S. cerevisiae ribosomal RNA (rRNA) using current signal deviations. Notably 2-O-methyl (Nm) modifications generated a discernible shift in current signal and event level dwell times. We show that dwell times are mediated by the RNA motor protein which sits atop the nanopore. Further, we characterize a recently described small adduct-generating 2-O-acylation reagent, acetylimidazole (AcIm) for exogenously labeling flexible nucleotides in RNA. Finally, we demonstrate the utility of AcIm for single molecule RNA structural probing using nanopore sequencing.

中文翻译：

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使用单分子纳米孔测序直接检测RNA修饰和结构

存在许多通过短读测序来检测RNA修饰的方法，这些方法依赖于带有修饰碱基的转录物的抗体富集或需要转换为cDNA的突变谱方法。内源修饰存在于几类主要的RNA中，包括tRNA，rRNA和mRNA，并且可以调节多种生物学过程，例如基因编码，mRNA输出和RNA折叠。另外，可以将外源修饰引入RNA分子以揭示RNA结构和动力学。基于短读取的方法固有的读取长度和文库大小的限制使修饰与它们的天然背景分离，从而阻止了单分子分析和修饰定相。在这里，我们展示了直接RNA纳米孔测序，可检测单分子水平上长距离序列中的内源性和外源性RNA修饰。我们展示了使用当前信号偏差全面检测大肠杆菌和酿酒酵母核糖体RNA（rRNA）中的内源性修饰。值得注意的是，2-O-甲基（Nm）修饰在电流信号和事件级停留时间上产生了明显的偏移。我们显示停留时间是由坐在纳米孔上面的RNA运动蛋白介导的。此外，我们表征最近描述的生成小加合物的2-O-酰化试剂乙酰咪唑（AcIm），用于外源标记RNA中的柔性核苷酸。最后，我们证明了AcIm用于使用纳米孔测序的单分子RNA结构探测的实用性。我们展示了使用当前信号偏差全面检测大肠杆菌和酿酒酵母核糖体RNA（rRNA）中的内源性修饰。值得注意的是，2-O-甲基（Nm）修饰在电流信号和事件级停留时间上产生了明显的偏移。我们显示停留时间是由坐在纳米孔上面的RNA运动蛋白介导的。此外，我们表征最近描述的生成小加合物的2-O-酰化试剂乙酰咪唑（AcIm），用于外源标记RNA中的柔性核苷酸。最后，我们证明了AcIm用于使用纳米孔测序的单分子RNA结构探测的实用性。我们展示了使用当前信号偏差全面检测大肠杆菌和酿酒酵母核糖体RNA（rRNA）中的内源性修饰。值得注意的是，2-O-甲基（Nm）修饰在电流信号和事件级停留时间上产生了明显的偏移。我们显示停留时间是由坐在纳米孔上面的RNA运动蛋白介导的。此外，我们表征最近描述的生成小加合物的2-O-酰化试剂乙酰咪唑（AcIm），用于外源标记RNA中的柔性核苷酸。最后，我们证明了AcIm用于使用纳米孔测序的单分子RNA结构探测的实用性。值得注意的是，2-O-甲基（Nm）修饰在电流信号和事件级停留时间上产生了明显的偏移。我们显示停留时间是由坐在纳米孔上面的RNA运动蛋白介导的。此外，我们表征最近描述的生成小加合物的2-O-酰化试剂乙酰咪唑（AcIm），用于外源标记RNA中的柔性核苷酸。最后，我们证明了AcIm用于使用纳米孔测序的单分子RNA结构探测的实用性。值得注意的是，2-O-甲基（Nm）修饰在电流信号和事件级停留时间上产生了明显的偏移。我们显示停留时间是由坐在纳米孔上面的RNA运动蛋白介导的。此外，我们表征最近描述的生成小加合物的2-O-酰化试剂乙酰咪唑（AcIm），用于外源标记RNA中的柔性核苷酸。最后，我们证明了AcIm在使用纳米孔测序的单分子RNA结构探测中的实用性。