Clathrin-mediated endocytosis (CME) is the gatekeeper of the plasma membrane. In contrast to animals and yeasts, CME in plants depends on the TPLATE complex (TPC), an evolutionary ancient adaptor complex. The mechanistic contribution of the individual TPC subunits to plant CME remains however elusive. In this study, we used a multidisciplinary approach to elucidate the structural and functional roles of the evolutionary conserved N-terminal Eps15 homology (EH) domains of the TPC subunit AtEH1/Pan1. By integrating high-resolution structural information obtained by X-ray crystallography and NMR spectroscopy with all-atom molecular dynamics simulations, we provide structural insight into the function of both EH domains. Whereas one EH domain binds negatively charged PI(4,5)P2 lipids, unbiased peptidome profiling by mass-spectrometry revealed that the other EH domain interacts with the double N-terminal NPF motif of a novel TPC interactor, the integral membrane protein Secretory Carrier Membrane Protein 5 (SCAMP5). Furthermore, we show that AtEH/Pan1 proteins control the internalization of SCAMP5 via this double NPF peptide interaction motif. Collectively, our structural and functional studies reveal distinct but complementary roles of the EH domains of AtEH/Pan1 have in plant CME and connect the internalization of SCAMP5 to the TPLATE complex.

中文翻译：

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内吞TPLATE复合物的不同EH结构域赋予脂质和蛋白质结合。

网格蛋白介导的内吞作用（CME）是质膜的守门员。与动物和酵母菌相反，植物中的CME依赖于TPLATE复合物（TPC），TPLATE复合物是一种进化的古老衔接子复合物。但是，单个TPC亚基对植物CME的机械作用仍然难以捉摸。在这项研究中，我们使用了多学科的方法来阐明TPC亚基AtEH1 / Pan1的进化保守N末端Eps15同源（EH）域的结构和功能作用。通过将X射线晶体学和NMR光谱学获得的高分辨率结构信息与全原子分子动力学模拟相集成，我们为两个EH域的功能提供了结构上的见识。而一个EH域结合带负电荷的PI（4,5）P2脂质，通过质谱进行的无偏肽谱分析表明，另一个EH结构域与新型TPC相互作用物，完整的膜蛋白分泌载体膜蛋白5（SCAMP5）的双N末端NPF基序相互作用。此外，我们显示，AtEH / Pan1蛋白通过这种双NPF肽相互作用基序控制SCAMP5的内在化。总的来说，我们的结构和功能研究揭示了AtEH / Pan1的EH结构域在植物CME中具有独特但互补的作用，并将SCAMP5的内在化与TPLATE复合物联系起来。我们显示，AtEH / Pan1蛋白通过这种双NPF肽相互作用基序控制SCAMP5的内在化。总的来说，我们的结构和功能研究揭示了AtEH / Pan1的EH结构域在植物CME中具有独特但互补的作用，并将SCAMP5的内在化与TPLATE复合物联系起来。我们显示，AtEH / Pan1蛋白通过这种双NPF肽相互作用基序控制SCAMP5的内在化。总的来说，我们的结构和功能研究揭示了AtEH / Pan1的EH结构域在植物CME中具有独特但互补的作用，并将SCAMP5的内在化与TPLATE复合物联系起来。