During the chemical and biochemical decomposition of lignocellulosic biomasses, lignin is highly recalcitrant. Genetic transformation of plants to qualitatively and/or quantitatively modify lignin may reduce these recalcitrant properties. Efficient discovery of genes to achieve lignin manipulation is thus required. To screen for new genes to reduce lignin recalcitrance, we heterologously expressed 50 enzymatic genes under the control of a cinnamate 4-hydroxylase (C4H) gene promoter, derived from a hybrid aspen, which is preferentially active in tissues with lignified cell walls in Arabidopsis plants. These genes encode enzymes that act on metabolites in shikimate, general phenylpropanoid, flavonoid, or monolignol biosynthetic pathways. Among these genes, 30, 18, and 2 originated from plants, bacteria, and fungi, respectively. In our first screening step, 296 independent transgenic plants (T1 generation) harboring single or multiple transgenes were generated from pools of seven Agrobacterium strains used for conventional floral-dip transformation. Wiesner and Mäule staining patterns in the stems of the resultant plants revealed seven and nine plants with apparent abnormalities in the two respective staining analyses. According to genomic PCR and subsequent direct sequencing, each of these 16 plants possessed a gene encoding either coniferaldehyde dehydrogenase (calB), feruloyl-CoA 6′-hydroxylase (F6H1), hydroxycinnamoyl-CoA hydratase/lyase (couA), or ferulate 5-hydroxylase (F5H), with one transgenic plant carrying both calB and F6H1. The effects of these genes on lignin manipulation were confirmed in individually re-created T1 transgenic Arabidopsis plants. While no difference in lignin content was detected in the transgenic lines compared with the wild type, lignin monomeric composition was changed in the transgenic lines. The observed compositional change in the transgenic plants carrying calB, couA, and F5H led to improved sugar release from cell walls after alkaline pretreatment. Simple colorimetric characterization of stem lignin is useful for simultaneous screening of many genes with the potential to reduce lignin recalcitrance. In addition to F5H, the positive control, we identified three enzyme-coding genes that can function as genetic tools for lignin manipulation. Two of these genes (calB and couA) accelerate sugar release from transgenic lignocelluloses.

中文翻译：

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鉴定具有通过拟南芥中的木质素操作降低生物量不顺应性的酶基因。

在木质纤维素生物质的化学和生化分解过程中，木质素是高度顽固的。定性和/或定量修饰木质素的植物遗传转化可以减少这些顽固的特性。因此需要有效地发现实现木质素操作的基因。为了筛选新基因以减少木质素的顽固性，我们在肉桂酸 4-羟化酶 (C4H) 基因启动子的控制下异源表达了 50 个酶基因，该基因启动子来源于杂种白杨，在拟南芥植物中具有木质化细胞壁的组织中优先具有活性. 这些基因编码作用于莽草酸、一般苯丙烷、类黄酮或单木酚生物合成途径中的代谢物的酶。在这些基因中，30、18和2个分别来自植物、细菌和真菌。在我们的第一个筛选步骤中，从用于常规花浸转化的 7 种农杆菌菌株库中产生了 296 株具有单个或多个转基因的独立转基因植物（T1 代）。所得植物茎中的 Wiesner 和 Mäule 染色模式显示，在两种染色分析中，有 7 株和 9 株植物出现明显异常。根据基因组 PCR 和随后的直接测序，这 16 株植物中的每株都具有编码松叶醛脱氢酶 (calB)、阿魏酰辅酶 A 6'-羟化酶 (F6H1)、羟基肉桂酰辅酶A 水合酶/裂解酶 (couA) 或阿魏酸 5-羟化酶 (F5H)，一株同时携带 calB 和 F6H1 的转基因植物。这些基因对木质素操作的影响在单独重建的 T1 转基因拟南芥植物中得到证实。虽然与野生型相比，在转基因品系中未检测到木质素含量的差异，但在转基因品系中木质素单体组成发生了变化。在携带 calB、couA 和 F5H 的转基因植物中观察到的组成变化导致碱性预处理后细胞壁的糖释放得到改善。茎木质素的简单比色表征可用于同时筛选许多具有降低木质素不顺从性的基因。除了阳性对照 F5H 之外，我们还鉴定了三个酶编码基因，它们可以作为木质素操作的遗传工具。其中两个基因（calB 和 couA）加速了转基因木质纤维素的糖释放。转基因品系中的木质素单体组成发生了变化。在携带 calB、couA 和 F5H 的转基因植物中观察到的组成变化导致碱性预处理后细胞壁的糖释放得到改善。茎木质素的简单比色表征可用于同时筛选许多具有降低木质素不顺从性的基因。除了阳性对照 F5H 之外，我们还鉴定了三个酶编码基因，它们可以作为木质素操作的遗传工具。其中两个基因（calB 和 couA）加速了转基因木质纤维素的糖释放。转基因品系中的木质素单体组成发生了变化。在携带 calB、couA 和 F5H 的转基因植物中观察到的组成变化导致碱性预处理后细胞壁的糖释放得到改善。茎木质素的简单比色表征可用于同时筛选许多具有降低木质素不顺从性的基因。除了阳性对照 F5H 之外，我们还鉴定了三个酶编码基因，它们可以作为木质素操作的遗传工具。其中两个基因（calB 和 couA）加速了转基因木质纤维素的糖释放。茎木质素的简单比色表征可用于同时筛选许多具有降低木质素不顺从性的基因。除了阳性对照 F5H 之外，我们还鉴定了三个酶编码基因，它们可以作为木质素操作的遗传工具。其中两个基因（calB 和 couA）加速了转基因木质纤维素的糖释放。茎木质素的简单比色表征可用于同时筛选许多具有降低木质素不顺从性的基因。除了阳性对照 F5H 之外，我们还鉴定了三个酶编码基因，它们可以作为木质素操作的遗传工具。其中两个基因（calB 和 couA）加速了转基因木质纤维素的糖释放。