Background The blood–brain barrier (BBB) plays an important role as a biological barrier by regulating molecular transport between circulating blood and the brain parenchyma. In drug development, the accurate evaluation of BBB permeability is essential to predict not only the efficacy but also the safety of drugs. Recently, brain microvascular endothelial-like cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have attracted much attention. However, the differentiation protocol has not been optimized, and the enhancement of iPSC-derived brain microvascular endothelial-like cells (iBMELCs) function is required to develop highly functional BBB models for pharmaceutical research. Thus, we attempted to improve the functions of differentiated iBMELCs and develop a versatile BBB model by modulating TGF-β signaling pathway without implementing complex techniques such as co-culture systems. Methods iPSCs were differentiated into iBMELCs, and TGF-β inhibitor was used in the late stage of differentiation. To investigate the effect of TGF-β on freezing–thawing, iBMELCs were frozen for 60–90 min or 1 month. The barrier integrity of iBMELCs was evaluated by transendothelial electrical resistance (TEER) values and permeability of Lucifer yellow. Characterization of iBMELCs was conducted by RT-qPCR, immunofluorescence analysis, vascular tube formation assay, and acetylated LDL uptake assay. Functions of efflux transporters were defined by intracellular accumulation of the substrates. Results When we added a TGF-β inhibitor during iBMELCs differentiation, expression of the vascular endothelial cell marker was increased and blood vessel-like structure formation was enhanced. Furthermore, TEER values were remarkably increased in three iPSC lines. Additionally, it was revealed that TGF-β pathway inhibition suppressed the damage caused by the freezing–thawing of iBMELCs. Conclusion We succeeded in significantly enhancing the function and endothelial characteristics of iBMELCs by adding a small molecular compound, a TGF-β inhibitor. Moreover, the iBMELCs could maintain high barrier function even after freezing–thawing. Taken together, these results suggest that TGF-β pathway inhibition may be useful for developing iPSC-derived in vitro BBB models for further pharmaceutical research.

中文翻译：

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抑制转化生长因子β信号通路促进人诱导多能干细胞源脑微血管内皮样细胞分化

背景 血脑屏障 (BBB) 通过调节循环血液和脑实质之间的分子运输作为生物屏障发挥着重要作用。在药物开发中，准确评估 BBB 通透性不仅对预测药物的疗效而且对预测药物的安全性至关重要。最近，源自人类诱导多能干细胞（iPSCs）的脑微血管内皮样细胞备受关注。然而, 分化协议尚未优化, 需要增强 iPSC 衍生的脑微血管内皮样细胞 (iBMELCs) 功能, 以开发用于药物研究的高功能 BBB 模型。因此，我们试图通过调节 TGF-β 信号通路来改善分化的 iBMELCs 的功能并开发多功能的 BBB 模型，而无需实施复杂的技术，例如共培养系统。方法将iPSCs分化为iBMELCs，分化后期使用TGF-β抑制剂。为了研究 TGF-β 对冻融的影响，将 iBMELCs 冷冻 60-90 分钟或 1 个月。iBMELCs 的屏障完整性通过跨内皮电阻 (TEER) 值和路西法黄的渗透性进行评估。iBMELCs 的表征是通过 RT-qPCR、免疫荧光分析、血管形成测定和乙酰化 LDL 摄取测定进行的。外排转运蛋白的功能由底物的细胞内积累定义。结果当我们在 iBMELCs 分化过程中添加 TGF-β 抑制剂时，血管内皮细胞标志物的表达增加，血管样结构形成增强。此外，三个 iPSC 系的 TEER 值显着增加。此外，还发现 TGF-β 通路抑制抑制了 iBMELCs 冻融造成的损伤。结论 我们通过添加小分子化合物 TGF-β 抑制剂成功地显着增强了 iBMELCs 的功能和内皮特性。此外，即使在冻融后，iBMELCs 也能保持高屏障功能。总之，这些结果表明 TGF-β 通路抑制可能有助于开发 iPSC 衍生的体外 BBB 模型以进行进一步的药物研究。血管内皮细胞标志物的表达增加，血管样结构形成增强。此外，三个 iPSC 系的 TEER 值显着增加。此外，还发现 TGF-β 通路抑制抑制了 iBMELCs 冻融造成的损伤。结论 我们通过添加小分子化合物 TGF-β 抑制剂成功地显着增强了 iBMELCs 的功能和内皮特性。此外，即使在冻融后，iBMELCs 也能保持高屏障功能。总之，这些结果表明 TGF-β 通路抑制可能有助于开发 iPSC 衍生的体外 BBB 模型以进行进一步的药物研究。血管内皮细胞标志物的表达增加，血管样结构形成增强。此外，三个 iPSC 系的 TEER 值显着增加。此外，还发现 TGF-β 通路抑制抑制了 iBMELCs 冻融造成的损伤。结论 我们通过添加小分子化合物 TGF-β 抑制剂成功地显着增强了 iBMELCs 的功能和内皮特性。此外，即使在冻融后，iBMELCs 也能保持高屏障功能。总之，这些结果表明 TGF-β 通路抑制可能有助于开发 iPSC 衍生的体外 BBB 模型以进行进一步的药物研究。三个 iPSC 系的 TEER 值显着增加。此外，还发现 TGF-β 通路抑制抑制了 iBMELCs 冻融造成的损伤。结论 我们通过添加小分子化合物 TGF-β 抑制剂成功地显着增强了 iBMELCs 的功能和内皮特性。此外，即使在冻融后，iBMELCs 也能保持高屏障功能。总之，这些结果表明 TGF-β 通路抑制可能有助于开发 iPSC 衍生的体外 BBB 模型以进行进一步的药物研究。三个 iPSC 系的 TEER 值显着增加。此外，还发现 TGF-β 通路抑制抑制了 iBMELCs 冻融造成的损伤。结论 我们通过添加小分子化合物 TGF-β 抑制剂成功地显着增强了 iBMELCs 的功能和内皮特性。此外，即使在冻融后，iBMELCs 也能保持高屏障功能。总之，这些结果表明 TGF-β 通路抑制可能有助于开发 iPSC 衍生的体外 BBB 模型以进行进一步的药物研究。结论 我们通过添加小分子化合物 TGF-β 抑制剂成功地显着增强了 iBMELCs 的功能和内皮特性。此外，即使在冻融后，iBMELCs 也能保持高屏障功能。总之，这些结果表明 TGF-β 通路抑制可能有助于开发 iPSC 衍生的体外 BBB 模型以进行进一步的药物研究。结论 我们通过添加小分子化合物 TGF-β 抑制剂成功地显着增强了 iBMELCs 的功能和内皮特性。此外，即使在冻融后，iBMELCs 也能保持高屏障功能。总之，这些结果表明 TGF-β 通路抑制可能有助于开发 iPSC 衍生的体外 BBB 模型以进行进一步的药物研究。