SIGNIFICANCE Advanced genetic characterization has informed cancer heterogeneity and the challenge it poses to effective therapy; however, current methods lack spatial context, which is vital to successful cancer therapy. Conventional immunolabeling, commonplace in the clinic, can provide spatial context to protein expression. However, these techniques are spectrally limited, resulting in inadequate capacity to resolve the heterogenous cell subpopulations within a tumor. AIM We developed and optimized oligonucleotide conjugated antibodies (Ab-oligo) to facilitate cyclic immunofluorescence (cyCIF), resulting in high-dimensional immunostaining. APPROACH We employed a site-specific conjugation strategy to label antibodies with unique oligonucleotide sequences, which were hybridized in situ with their complementary oligonucleotide sequence tagged with a conventional fluorophore. Antibody concentration, imaging strand concentration, and configuration as well as signal removal strategies were optimized to generate maximal staining intensity using our Ab-oligo cyCIF strategy. RESULTS We successfully generated 14 Ab-oligo conjugates and validated their antigen specificity, which was maintained in single color staining studies. With the validated antibodies, we generated up to 14-color imaging data sets of human breast cancer tissues. CONCLUSIONS Herein, we demonstrated the utility of Ab-oligo cyCIF as a platform for highly multiplexed imaging, its utility to measure tumor heterogeneity, and its potential for future use in clinical histopathology.

中文翻译：

---

寡核苷酸偶联抗体允许高度多重免疫荧光用于临床组织病理学的未来用途。

意义 先进的遗传学表征揭示了癌症的异质性及其对有效治疗带来的挑战；然而，目前的方法缺乏空间背景，这对于成功的癌症治疗至关重要。常规的免疫标记在临床中很常见，可以为蛋白质表达提供空间背景。然而，这些技术在光谱上受到限制，导致解析肿瘤内异质细胞亚群的能力不足。目的 我们开发并优化了寡核苷酸偶联抗体 (Ab-oligo) 以促进循环免疫荧光 (cyCIF)，从而实现高维免疫染色。方法我们采用位点特异性结合策略来标记具有独特寡核苷酸序列的抗体，它们与用常规荧光团标记的互补寡核苷酸序列原位杂交。使用我们的 Ab-oligo cyCIF 策略优化了抗体浓度、成像链浓度和配置以及信号去除策略，以产生最大的染色强度。结果我们成功生成了 14 种 Ab-oligo 偶联物并验证了它们的抗原特异性，这在单色染色研究中得到了维持。使用经过验证的抗体，我们生成了多达 14 色的人类乳腺癌组织成像数据集。结论在此，我们展示了 Ab-oligo cyCIF 作为高度多重成像平台的实用性、其测量肿瘤异质性的实用性以及其未来在临床组织病理学中的应用潜力。使用我们的 Ab-oligo cyCIF 策略优化成像链浓度、配置以及信号去除策略以产生最大染色强度。结果我们成功生成了 14 种 Ab-oligo 偶联物并验证了它们的抗原特异性，这在单色染色研究中得到了维持。使用经过验证的抗体，我们生成了多达 14 色的人类乳腺癌组织成像数据集。结论在此，我们展示了 Ab-oligo cyCIF 作为高度多重成像平台的实用性、其测量肿瘤异质性的实用性以及其未来在临床组织病理学中的应用潜力。使用我们的 Ab-oligo cyCIF 策略优化成像链浓度、配置以及信号去除策略以产生最大染色强度。结果我们成功生成了 14 种 Ab-oligo 偶联物并验证了它们的抗原特异性，这在单色染色研究中得到了维持。使用经过验证的抗体，我们生成了多达 14 色的人类乳腺癌组织成像数据集。结论在此，我们展示了 Ab-oligo cyCIF 作为高度多重成像平台的实用性、其测量肿瘤异质性的实用性以及其未来在临床组织病理学中的应用潜力。结果我们成功生成了 14 种 Ab-oligo 偶联物并验证了它们的抗原特异性，这在单色染色研究中得到了维持。使用经过验证的抗体，我们生成了多达 14 色的人类乳腺癌组织成像数据集。结论在此，我们展示了 Ab-oligo cyCIF 作为高度多重成像平台的实用性、其测量肿瘤异质性的实用性以及其未来在临床组织病理学中的应用潜力。结果我们成功生成了 14 种 Ab-oligo 偶联物并验证了它们的抗原特异性，这在单色染色研究中得到了维持。使用经过验证的抗体，我们生成了多达 14 色的人类乳腺癌组织成像数据集。结论在此，我们展示了 Ab-oligo cyCIF 作为高度多重成像平台的实用性、其测量肿瘤异质性的实用性以及其未来在临床组织病理学中的应用潜力。