Recombinant adenoviruses are widely used for delivery and expression of transgenes for therapeutic purposes and in fundamental research. AdEasy™ adenoviral vector system allows for rapid and efficient generation of replication-deficient adenoviruses. One important crucial step in producing recombinant adenoviruses is the generation of a recombinant adenoviral plasmid in E. coli BJ5183 cells via homologous recombination between the transgene encoding shuttle vector and the pAdEasy-1 plasmid, which carries a significant part of human adenovirus serotype 5 (Ad5) genome. In many published protocols, the necessity of electroporation for the transformation of the shuttle vector and pAdEasy-1 into E. coli cells is emphasized, thus making necessary the availability of the appropriate instruments and consumables. Here, we have proposed an optimized protocol for the generation of recombinant adenoviruses with the use of chemically competent E. coli cells only, without the use of electroporation. We have demonstrated the efficient transformation of linearized nonpurified shuttle vector into chemically competent E. coli BJ5183-pAdEasy-1 cells allowing identification of clones with correct recombinant adenoviral plasmids. Using the optimized protocol, we have generated four functional replication-deficient adenoviruses expressing target proteins in HEK293 cells. The protocol that has been suggested provides a significantly simplified and cheaper method for the generation of recombinant adenoviruses due to lack of requirement to use instruments and consumables for electroporation.

中文翻译：

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一种用于生成重组腺病毒质粒的优化无电穿孔方法

重组腺病毒广泛用于递送和表达用于治疗目的和基础研究的转基因。AdEasy™ 腺病毒载体系统可以快速有效地生成复制缺陷型腺病毒。生产重组腺病毒的一个重要步骤是在大肠杆菌 BJ5183 细胞中通过编码穿梭载体的转基因与 pAdEasy-1 质粒之间的同源重组产生重组腺病毒质粒，pAdEasy-1 质粒携带人腺病毒血清型 5 (Ad5 ) 基因组。在许多已发表的协议中，强调了将穿梭载体和 pAdEasy-1 转化为大肠杆菌细胞的电穿孔的必要性，因此有必要提供适当的仪器和耗材。这里，我们提出了一种优化方案，用于仅使用具有化学活性的大肠杆菌细胞生成重组腺病毒，而不使用电穿孔。我们已经证明了线性化的未纯化穿梭载体可以有效地转化为具有化学活性的大肠杆菌 BJ5183-pAdEasy-1 细胞，从而可以鉴定具有正确重组腺病毒质粒的克隆。使用优化的协议，我们生成了四种功能性复制缺陷腺病毒，在 HEK293 细胞中表达目标蛋白。由于不需要使用仪器和耗材进行电穿孔, 所建议的协议为重组腺病毒的生成提供了一种显着简化和更便宜的方法。仅大肠杆菌细胞，不使用电穿孔。我们已经证明了线性化的非纯化穿梭载体可以有效地转化为具有化学活性的大肠杆菌 BJ5183-pAdEasy-1 细胞，从而可以鉴定具有正确重组腺病毒质粒的克隆。使用优化的协议，我们生成了四种功能性复制缺陷腺病毒，在 HEK293 细胞中表达目标蛋白。由于不需要使用仪器和耗材进行电穿孔, 所建议的协议为重组腺病毒的生成提供了一种显着简化和更便宜的方法。仅大肠杆菌细胞，不使用电穿孔。我们已经证明了线性化的非纯化穿梭载体可以有效地转化为具有化学活性的大肠杆菌 BJ5183-pAdEasy-1 细胞，从而可以鉴定具有正确重组腺病毒质粒的克隆。使用优化的协议，我们在 HEK293 细胞中生成了四种功能性复制缺陷腺病毒表达目标蛋白。由于不需要使用仪器和耗材进行电穿孔, 所建议的协议为重组腺病毒的生成提供了一种显着简化和更便宜的方法。大肠杆菌 BJ5183-pAdEasy-1 细胞允许鉴定具有正确重组腺病毒质粒的克隆。使用优化的协议，我们生成了四种功能性复制缺陷腺病毒，在 HEK293 细胞中表达目标蛋白。由于不需要使用仪器和耗材进行电穿孔, 所建议的协议为重组腺病毒的生成提供了一种显着简化和更便宜的方法。大肠杆菌 BJ5183-pAdEasy-1 细胞允许鉴定具有正确重组腺病毒质粒的克隆。使用优化的协议，我们生成了四种功能性复制缺陷腺病毒，在 HEK293 细胞中表达目标蛋白。由于不需要使用仪器和耗材进行电穿孔, 所建议的协议为重组腺病毒的生成提供了一种显着简化和更便宜的方法。