The slipper limpet Crepidula fornicata is an invasive, non-native, marine species found throughout the coastal waters of southern England and Wales, UK. These limpets are considered to blight commercial shellfish banks, notably oysters, yet little is known about their disease-carrying capacity or their immunobiology. To address the latter, we isolated haemolymph (blood) from limpets and tested for the presence of the immune-enzyme phenoloxidase. Invertebrate phenoloxidases produce melanic polymers from simple phenolic substrates, which are deployed in the presence of pathogens because of their potent microbicidal and microbiostatic properties. We used a series of established substrates (e.g., tyrosine, hydroquinone) and inhibitors (e.g., 4-hexylresorcinol, benzoic acid) to target three distinct enzymes: laccase (para-diphenoloxidase), catecholoxidase (ortho-diphenoloxidase) and tyrosinase (monophenoloxidase). We confirmed laccase and catecholoxidase activities and characterised their kinetic properties across temperature and pH gradients (5-70 °C and 5-10, respectively). Crucially, we demonstrated that products derived from such laccase and catecholoxidase activities reduced significantly the numbers of colony-forming units of both Gram-positive and Gram-negative bacteria in vitro. We further screened limpet tissues for signs of melanin using wax histology, and found cells replete with eumelanin-like pigments and lipofuscin in the digestive gland, connective tissues, barrier epithelia and gills. Our data represent the first account of enzyme-based antibacterial defences, notably laccase, in C. fornicata.

中文翻译：

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漆酶和儿茶酚氧化酶活性有助于拖鞋帽贝 (Crepidula fornicata) 的先天免疫。

拖鞋帽贝 Crepidula fornicata 是一种外来入侵的海洋物种，分布在英格兰南部和英国威尔士的沿海水域。这些帽贝被认为会破坏商业贝类库，尤其是牡蛎，但对其携带疾病的能力或免疫生物学知之甚少。为了解决后者，我们从帽贝中分离了血淋巴（血液）并测试了免疫酶酚氧化酶的存在。无脊椎动物酚氧化酶从简单的酚类底物产生黑色聚合物，由于它们具有有效的杀微生物和微生物抑制特性，因此可以在病原体存在的情况下使用。我们使用了一系列已建立的底物（例如酪氨酸、对苯二酚）和抑制剂（例如 4-己基间苯二酚、苯甲酸）来靶向三种不同的酶：漆酶（对二酚氧化酶）、儿茶酚氧化酶（邻二酚氧化酶）和酪氨酸酶（单酚氧化酶）。我们确认了漆酶和儿茶酚氧化酶的活性，并表征了它们在温度和 pH 梯度（分别为 5-70 °C 和 5-10 °C）下的动力学特性。至关重要的是，我们证明了源自此类漆酶和儿茶酚氧化酶活性的产品在体外显着减少了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的菌落形成单位的数量。我们使用蜡组织学进一步筛选了帽贝组织的黑色素迹象，并发现消化腺、结缔组织、屏障上皮和鳃中的细胞充满真黑色素样色素和脂褐素。我们的数据代表了在 C. fornicata 中基于酶的抗菌防御的第一个帐户，特别是漆酶。我们确认了漆酶和儿茶酚氧化酶的活性，并表征了它们在温度和 pH 梯度（分别为 5-70 °C 和 5-10 °C）下的动力学特性。至关重要的是，我们证明了源自这种漆酶和儿茶酚氧化酶活性的产品在体外显着减少了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的菌落形成单位的数量。我们使用蜡组织学进一步筛选了帽贝组织的黑色素迹象，并发现消化腺、结缔组织、屏障上皮和鳃中的细胞充满真黑色素样色素和脂褐素。我们的数据代表了在 C. fornicata 中基于酶的抗菌防御的第一个帐户，特别是漆酶。我们确认了漆酶和儿茶酚氧化酶的活性，并表征了它们在温度和 pH 梯度（分别为 5-70 °C 和 5-10 °C）下的动力学特性。至关重要的是，我们证明了源自这种漆酶和儿茶酚氧化酶活性的产品在体外显着减少了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的菌落形成单位的数量。我们使用蜡组织学进一步筛选了帽贝组织的黑色素迹象，并发现消化腺、结缔组织、屏障上皮和鳃中的细胞充满真黑色素样色素和脂褐素。我们的数据代表了在 C. fornicata 中基于酶的抗菌防御的第一个帐户，特别是漆酶。分别）。至关重要的是，我们证明了源自这种漆酶和儿茶酚氧化酶活性的产品在体外显着减少了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的菌落形成单位的数量。我们使用蜡组织学进一步筛选了帽贝组织的黑色素迹象，并发现消化腺、结缔组织、屏障上皮和鳃中的细胞充满真黑色素样色素和脂褐素。我们的数据代表了在 C. fornicata 中基于酶的抗菌防御的第一个帐户，特别是漆酶。分别）。至关重要的是，我们证明了源自这种漆酶和儿茶酚氧化酶活性的产品在体外显着减少了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的菌落形成单位的数量。我们使用蜡组织学进一步筛选了帽贝组织的黑色素迹象，并发现消化腺、结缔组织、屏障上皮和鳃中的细胞充满真黑色素样色素和脂褐素。我们的数据代表了在 C. fornicata 中基于酶的抗菌防御的第一个帐户，特别是漆酶。并发现消化腺、结缔组织、屏障上皮和鳃中的细胞充满真黑素样色素和脂褐素。我们的数据代表了在 C. fornicata 中基于酶的抗菌防御的第一个帐户，特别是漆酶。并发现消化腺、结缔组织、屏障上皮和鳃中的细胞充满真黑素样色素和脂褐素。我们的数据代表了在 C. fornicata 中基于酶的抗菌防御的第一个帐户，特别是漆酶。