Cheese lacks essential fatty acids (EFAs). Delta 12 fatty acid desaturase (FADS12) is a critical enzyme required for EFA biosynthesis in fermentation of the predominant strains of cheese. Previously, we identified the FADS12 gene and characterized its function for the first time in Geotrichum candidum, a dominant strain used to manufacture soft cheese with white rind. In this study, we analyzed the molecular mechanism of FADS12 function by swapping domains from Mortierella alpina and G. candidum that had, respectively, high and low oleic acid conversion rates. The results revealed three regions that are essential to this process, including regions from the end of the second transmembrane domain to the beginning of the third transmembrane domain, from the end of the third transmembrane domain to the beginning of the fourth transmembrane domain, and from the 30-amino acid from the end of the sixth transmembrane domain to the C-terminal end region. Based on our domain swapping analyses, nine pairs of amino acids including H112, S118, H156, Q161, K301, R306, E307, A309 and S323 in MaFADS12 (K123, A129, N167, M172, T302, D307, I308, E310 and D324 in GcFADS12) were identified as having a significantly effect on FADS12 catalytic efficiency, and linoleic acid and its analogues (12,13-cyclopropenoid fatty acid) were found to inhibit the catalytic activity of FADS12 and related recombinant enzymes. Furthermore, the molecular mechanism of FADS12 inhibition was analyzed. The results revealed two allosteric domains, including one domain from the N-terminal region to the beginning of the first transmembrane domain and another from the 31st amino acid from the end of the sixth transmembrane domain to the C terminus. Y4 and F398 amino acid residues from MaFADS12 and eight pairs of amino acids including G56, L60, L344, G10, Q13, S24, K326 and L344 in MaFADS12 (while Y66, F70, F345, F20, Y23, Y34, F327 and F345 in GcFADS12) played a pivotal role in FADS12 inhibition. Finally, we found that both allosteric and active sites were responsible for the catalytic activity of FADS12 at various temperatures, pH, and times. This study offers a solid theoretical basis to develop preconditioning methods to increase the rate at which GcFADS12 converts oleic and linoleic acids to produce higher levels of EFAs in cheese.

中文翻译：

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域交换法测定白地霉和高山被孢霉中 Delta 12 脂肪酸去饱和酶催化活性的变构位点和活性位点

奶酪缺乏必需脂肪酸（EFA）。Delta 12 脂肪酸去饱和酶 (FADS12) 是主要奶酪菌株发酵中 EFA 生物合成所需的关键酶。此前，我们首次鉴定了 FADS12 基因并在白地霉中首次表征了其功能，白地霉是一种用于制造白皮软奶酪的优势菌株。在这项研究中，我们通过交换分别具有高油酸转化率和低油酸转化率的高山被孢霉和念珠菌的结构域来分析 FADS12 功能的分子机制。结果揭示了这个过程中必不可少的三个区域，包括从第二个跨膜域末端到第三个跨膜域开始的区域，从第三个跨膜域末端到第四个跨膜域开始的区域，从第 6 个跨膜结构域末端到 C 末端区域的 30 个氨基酸。根据我们的域交换分析，MaFADS12 中的九对氨基酸包括 H112、S118、H156、Q161、K301、R306、E307、A309 和 S323（K123、A129、N167、M172、T302、D303 和 E307、E323 GcFADS12) 被鉴定为对 FADS12 催化效率有显着影响，并且发现亚油酸及其类似物（12,13-环丙烯脂肪酸）抑制 FADS12 和相关重组酶的催化活性。此外，还分析了 FADS12 抑制的分子机制。结果揭示了两个变构结构域，包括从N-末端区域到第一个跨膜结构域的开始的一个结构域和从第六个跨膜结构域末端到C末端的第31个氨基酸的另一个结构域。MaFADS12 中的 Y4 和 F398 氨基酸残基和 MaFADS12 中的八对氨基酸包括 G56、L60、L344、G10、Q13、S24、K326 和 L344（而 Y66、F70、F345、F20、Y23、Y34、F4527 和 F3 GcFADS12) 在 FADS12 抑制中发挥了关键作用。最后，我们发现变构位点和活性位点都对 FADS12 在不同温度、pH 值和时间下的催化活性负责。该研究为开发预处理方法提供了坚实的理论基础，以提高 GcFADS12 转化油酸和亚油酸的速率，从而在奶酪中产生更高水平的 EFA。MaFADS12 中的 Y4 和 F398 氨基酸残基以及 MaFADS12 中的八对氨基酸包括 G56、L60、L344、G10、Q13、S24、K326 和 L344（而 Y66、F70、F345、F20、Y23、Y34、F4527 和 F3 GcFADS12) 在 FADS12 抑制中发挥了关键作用。最后，我们发现变构位点和活性位点都对 FADS12 在不同温度、pH 值和时间下的催化活性负责。该研究为开发预处理方法提供了坚实的理论基础，以提高 GcFADS12 转化油酸和亚油酸的速率，从而在奶酪中产生更高水平的 EFA。MaFADS12 中的 Y4 和 F398 氨基酸残基和 MaFADS12 中的八对氨基酸包括 G56、L60、L344、G10、Q13、S24、K326 和 L344（而 Y66、F70、F345、F20、Y23、Y34、F4527 和 F3 GcFADS12) 在 FADS12 抑制中发挥了关键作用。最后，我们发现变构位点和活性位点都对 FADS12 在不同温度、pH 值和时间下的催化活性负责。该研究为开发预处理方法提供了坚实的理论基础，以提高 GcFADS12 转化油酸和亚油酸的速率，从而在奶酪中产生更高水平的 EFA。我们发现变构位点和活性位点都对 FADS12 在不同温度、pH 值和时间下的催化活性负责。该研究为开发预处理方法提供了坚实的理论基础，以提高 GcFADS12 转化油酸和亚油酸的速率，从而在奶酪中产生更高水平的 EFA。我们发现变构位点和活性位点都对 FADS12 在不同温度、pH 值和时间下的催化活性负责。该研究为开发预处理方法提供了坚实的理论基础，以提高 GcFADS12 转化油酸和亚油酸的速率，从而在奶酪中产生更高水平的 EFA。