Abstract Antibodies are commonly used as detection elements in biosensors. Antibody orientation on transducer surface determines immunological recognition and biosensor performance. Although a relation between antibody orientation and adsorbed amount Γ was predicted, assuming close packing of proteins, and even applied to infer the preferred orientation from indirect surface analysis, the issue has not been so far examined experimentally with the surface techniques probing directly antibody orientation for a wide Γ range covering all possible antibody orientations. In this work, time-of-flight secondary ion mass spectrometry combined with Principal Component Analysis probes the orientation of immunoglobulin G (aIgG) immobilized on silane-modified silicon surface with surface density 0 ≤ Γ ≤ 3 mg/m2, determined with ellipsometry. Two covalent immobilization methods: with NHS-silane and with amino-silane followed by glutaraldehyde (GA) activation, are compared. Atomic Force Microscopy reveals surface density dependent nanostructure of aIgG layers. AFM and PCA of TOF-SIMS clearly distinguish between the Γ ranges of flat-on, side-on and vertical aIgG orientation, that accord with random molecular packing. For vertical aIgG arrangement, a dominant head-on orientation and a mixed tail-on/head-on orientation is concluded from PCA for GA- and NHS-surface modification, respectively. In addition, molar binding ratio of antigen to antibody accords with the determined surface density dependent aIgG orientation.

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硅上抗体的表面密度依赖性取向和免疫识别：TOF-SIMS 和两种共价固定方法的表面分析

摘要 抗体是生物传感器中常用的检测元件。传感器表面的抗体取向决定了免疫识别和生物传感器的性能。尽管预测了抗体方向和吸附量 Γ 之间的关系，假设蛋白质紧密堆积，甚至应用于从间接表面分析中推断首选方向，但到目前为止，还没有通过表面技术通过直接探测抗体方向的表面技术对这个问题进行实验研究。广泛的Γ范围涵盖所有可能的抗体方向。在这项工作中，飞行时间二次离子质谱结合主成分分析探测了固定在硅烷改性硅表面上的免疫球蛋白 G (aIgG) 的取向，表面密度 0 ≤ Γ ≤ 3 mg/m2，用椭圆光度法测定。比较了两种共价固定方法：使用 NHS 硅烷和使用氨基硅烷，然后进行戊二醛 (GA) 活化。原子力显微镜揭示了 aIgG 层的表面密度依赖性纳米结构。TOF-SIMS 的 AFM 和 PCA 清楚地区分了平面、侧面和垂直 aIgG 取向的 Γ 范围，符合随机分子堆积。对于垂直 aIgG 排列，主要的正面方向和混合的尾部/正面方向分别从用于 GA 和 NHS 表面修饰的 PCA 得出。此外，抗原与抗体的摩尔结合比与确定的表面密度依赖性 aIgG 方向一致。原子力显微镜揭示了 aIgG 层的表面密度依赖性纳米结构。TOF-SIMS 的 AFM 和 PCA 清楚地区分了平面、侧面和垂直 aIgG 取向的 Γ 范围，符合随机分子堆积。对于垂直 aIgG 排列，主要的正面方向和混合的尾部/正面方向分别从用于 GA 和 NHS 表面修饰的 PCA 得出。此外，抗原与抗体的摩尔结合比与确定的表面密度依赖性 aIgG 方向一致。原子力显微镜揭示了 aIgG 层的表面密度依赖性纳米结构。TOF-SIMS 的 AFM 和 PCA 清楚地区分了平面、侧面和垂直 aIgG 取向的 Γ 范围，符合随机分子堆积。对于垂直 aIgG 排列，主要的正面方向和混合的尾部/正面方向分别从用于 GA 和 NHS 表面修饰的 PCA 得出。此外，抗原与抗体的摩尔结合比与确定的表面密度依赖性 aIgG 方向一致。从 PCA 得出的主要正面方向和混合的尾部/正面方向分别用于 GA 和 NHS 表面改性。此外，抗原与抗体的摩尔结合比与确定的表面密度依赖性 aIgG 方向一致。从 PCA 得出的主要正面方向和混合的尾部/正面方向分别用于 GA 和 NHS 表面改性。此外，抗原与抗体的摩尔结合比与确定的表面密度依赖性 aIgG 方向一致。