Identifying nuclease-induced double-stranded breaks in DNA on a genome-wide scale is critical for assessing the safety and efficacy of genome editing therapies. We previously demonstrated that after administering adeno-associated viral (AAV) vector-mediated genome-editing strategies in vivo, vector sequences integrated into the host organism’s genomic DNA at double-stranded breaks. Thus, identifying the genomic location of inserted AAV sequences would enable us to identify DSB events, mainly derived from the nuclease on- and off-target activity. Here, we developed a next-generation sequencing assay that detects insertions of specific AAV vector sequences called inverted terminal repeats (ITRs). This assay, ITR-Seq, enables us to identify off-target nuclease activity in vivo. Using ITR-Seq, we analyzed liver DNA samples of rhesus macaques treated with AAV vectors expressing a meganuclease. We found dose-dependent off-target activity and reductions in off-target events induced by further meganuclease development. In mice, we identified the genomic locations of ITR integration after treatment with Cas9 nucleases and their corresponding single-guide RNAs. In sum, ITR-Seq is a powerful method for identifying off-target sequences induced by AAV vector-delivered genome-editing nucleases. ITR-Seq will help us understand the specificity and efficacy of different genome-editing nucleases in animal models and clinical studies. This information can help enhance the safety profile of gene-editing therapies.

中文翻译：

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ITR-Seq是下一代测序测定法，可在腺相关病毒载体介导的基因组编辑后在体内鉴定全基因组DNA编辑位点

在全基因组范围内鉴定核酸酶诱导的DNA双链断裂对于评估基因组编辑疗法的安全性和有效性至关重要。我们以前证明了在体内应用腺相关病毒（AAV）载体介导的基因组编辑策略后，载体序列在双链断裂处整合到宿主生物体的基因组DNA中。因此，鉴定插入的AAV序列的基因组位置将使我们能够鉴定DSB事件，该事件主要源自核酸酶的靶标和脱靶活性。在这里，我们开发了一种下一代测序测定法，可以检测称为反向末端重复（ITR）的特定AAV矢量序列的插入。该测定法ITR-Seq使我们能够鉴定体内脱靶核酸酶活性。使用ITR-Seq，我们分析了表达大范围核酸酶的AAV载体处理的恒河猴的肝脏DNA样品。我们发现剂量依赖性脱靶活性和由进一步的大范围核酸酶发展诱导的脱靶事件的减少。在小鼠中，我们确定了Cas9核酸酶及其相应的单向导RNA处理后ITR整合的基因组位置。总之，ITR-Seq是鉴定由AAV载体递送的基因组编辑核酸酶诱导的脱靶序列的有效方法。ITR-Seq将帮助我们了解动物模型和临床研究中不同基因组编辑核酸酶的特异性和功效。这些信息可以帮助增强基因编辑疗法的安全性。我们发现剂量依赖性脱靶活性和由进一步的大范围核酸酶发展诱导的脱靶事件的减少。在小鼠中，我们确定了Cas9核酸酶及其相应的单向导RNA处理后ITR整合的基因组位置。总之，ITR-Seq是鉴定由AAV载体递送的基因组编辑核酸酶诱导的脱靶序列的有效方法。ITR-Seq将帮助我们了解动物模型和临床研究中不同基因组编辑核酸酶的特异性和功效。这些信息可以帮助增强基因编辑疗法的安全性。我们发现剂量依赖性脱靶活性和由进一步的大范围核酸酶发展诱导的脱靶事件的减少。在小鼠中，我们确定了Cas9核酸酶及其相应的单向导RNA处理后ITR整合的基因组位置。总而言之，ITR-Seq是鉴定由AAV载体递送的基因组编辑核酸酶诱导的脱靶序列的有力方法。ITR-Seq将帮助我们了解动物模型和临床研究中不同基因组编辑核酸酶的特异性和功效。这些信息可以帮助增强基因编辑疗法的安全性。ITR-Seq是鉴定由AAV载体递送的基因组编辑核酸酶诱导的脱靶序列的有力方法。ITR-Seq将帮助我们了解动物模型和临床研究中不同基因组编辑核酸酶的特异性和功效。这些信息可以帮助增强基因编辑疗法的安全性。ITR-Seq是鉴定由AAV载体递送的基因组编辑核酸酶诱导的脱靶序列的有力方法。ITR-Seq将帮助我们了解动物模型和临床研究中不同基因组编辑核酸酶的特异性和功效。这些信息可以帮助增强基因编辑疗法的安全性。